鬼臼毒素酊经皮外用安全性比较的实验研究

鬼臼毒素酊经皮外用安全性比较的实验研究

0总结0.5%鬼臼毒素溶剂是配方中推荐的治疗湿热疾病的第一种外用药物。1大鼠皮肤多次刺激试验设计:随机分组设计、动物对照观察。单位:柳州市人民医院皮肤科、南方医科大学南方医院皮肤科和药学部。材料:实验于2006-09/2007-08在南方医科大学药学部实验室完成。选择SPF级Wistar大鼠100只,体质量200~250g,雌雄各半;SPF级Fmmu豚鼠32只,体质量350~400g,雌雄各半,均由南方医科大学实验动物中心提供(合格证号分别为:2005A048,2005A041)。药物:0.5%鬼臼毒素-固体脂质纳米粒,0.5%鬼臼毒素酊剂(南方医科大学药学部提供)。仪器:CELL-DYN1700型血球计数仪(美国);7071A全自动生化检测仪(日本日立公司);脱水机、切片机(英国Shandon公司);LeicaTcsSp2型激光共聚焦显微镜(德国Leica公司)。设计、实施、评估者:设计及实施为第一、二作者,评估为全部作者,均经过专业培训。方法:豚鼠皮肤刺激性试验:(1)急性皮肤刺激试验:取豚鼠16只,按随机数字表法分成4组,即0.5%鬼臼毒素-固体脂质纳米粒完整皮肤组、0.5%鬼臼毒素-固体脂质纳米粒破损皮肤组、0.5%鬼臼毒素酊剂完整皮肤组和0.5%鬼臼毒素酊剂破损皮肤组,每组4只。实验开始前24h将豚鼠背部两侧对称脱毛,脱毛面积左、右各3cm×3cm。破损皮肤组豚鼠用手术刀片在脱毛皮肤区域作#字划痕,以渗血为度。采用同体左右侧自身对照法,左侧为受试区,分别取0.5%鬼臼毒素-固体脂质纳米粒混悬液及0.5%鬼臼毒素酊剂各0.1mL均匀涂布于受试区,右侧为空白对照区,再以自制单层塑料薄膜和双层纱布封包受试区。封包4h后分别于去除敷料和清洗受试物后1,24,48h观察涂药部位有无红斑和水肿等情况,以及上述变化的恢复情况与时间,按照每天每只动物平均积分=∑(红斑和水肿总积分/受试动物数)和参照文后参考文献[6]表12-1与12-2进行皮肤反应积分和刺激强度评价。(2)多次皮肤刺激试验:另取豚鼠16只,分组、皮肤处理方法、观察指标及评价指标同急性皮肤刺激试验,每日给药1次,连续给药14d。大鼠皮肤毒性试验:(1)急性皮肤毒性试验:取大鼠50只,按随机数字表法分成5组,即0.5%鬼臼毒素-固体脂质纳米粒完整皮肤组、0.5%鬼臼毒素-固体脂质纳米粒破损皮肤组、0.5%鬼臼毒素酊剂完整皮肤组和0.5%鬼臼毒素酊剂破损皮肤组及正常对照组,每组10只。给药前24h将大鼠背部两侧对称脱毛,脱毛面积为6cm×7cm。破损皮肤组大鼠用手术刀片在脱毛皮肤区域作#字划痕,以渗血为度。然后分别取0.5%鬼臼毒素-固体脂质纳米粒、0.5%鬼臼毒素酊剂1mL均匀涂布于脱毛区,再以自制单层塑料薄膜和双层纱布封包受试区,4h后去除敷料和清洗受试物。连续观察14d,每日观察大鼠体质量、进食量、呼吸、体态、眼、中枢神经系统、四肢活动、粪便性状及死亡情况。(2)长期皮肤毒性试验:另取大鼠50只,分组、皮肤处理方法及观察指标同急性皮肤毒性试验,每日给药1次,药量均为0.1mL,连续给药30d,末次给药后24h用0.6~1.0mL的水合氯醛麻醉动物,取腹主动脉血3.0~4.0mL进行血液学、血液生化学检查,然后用颈椎脱臼法处死动物。分别切取各组大鼠涂药中心区域的皮肤组织,大小约0.5cm×0.5cm,固定于10%甲醛溶液中,将固定24h的皮肤组织进行冲水、脱水、透明、浸蜡、包埋,然后用常规石蜡切片技术进行连续切片,片厚4~6μm,选取来自同一动物标本的组织切片各2张,分别给予苏木精-伊红染色、封固行组织病理检查和不染色、不封固行激光共聚焦显微镜扫描,以观察在给药结束后各组皮肤组织病理变化和鬼臼毒素在皮肤各层的分布特点。激光共聚焦显微镜激发光谱为紫外光,扫描波长为620~700nm,荧光呈现红色,荧光强弱间接定量荧光药物。主要观察指标:豚鼠皮肤刺激性试验结果,大鼠皮肤毒性试验结果。统计学分析:由第一作者采用以SPSS10.0进行数据处理,计量资料以2结果2.1动物的数量分析2.2皮肤刺激试验结果2.2.1皮肤刺激性评价0.5%鬼臼毒素-固体脂质纳米粒完整皮肤和破损皮肤组、0.5%鬼臼毒素酊剂完整皮肤组豚鼠在去除敷料和受试物的1~48h,受试区皮肤均未见红斑和水肿等情况,皮肤刺激反应平均评分值均为0,皮肤刺激强度评价均为无刺激性。0.5%鬼臼毒素酊剂破损皮肤组豚鼠在去除敷料和受试物的1~24h,破损区皮肤及其周围均出现轻度的红斑和水肿,至48h红斑、水肿达高峰,此后的2~5d刺激反应逐渐消退,皮肤刺激反应平均评分值为2.75,皮肤刺激强度评价为轻度刺激性。试验结果说明:在有效观察时间内,单次给予0.5%鬼臼毒素-固体脂质纳米粒对豚鼠完整和破损皮肤均无刺激性。单次给予0.5%鬼臼毒素酊剂对豚鼠完整皮肤无刺激性,对破损皮肤有较强的刺激性。2.2.2多次多次给药皮肤多次刺激试验结果0.5%鬼臼毒素-固体脂质纳米粒完整皮肤和破损皮肤组豚鼠在去除敷料和受试物的1~48h,受试区皮肤均未见红斑和水肿等情况,皮肤刺激反应平均评分值均为0,皮肤刺激强度评价均为无刺激性。0.5%鬼臼毒素酊剂完整皮肤组豚鼠于给药后的4~7d皮肤出现轻度红斑、水肿,此后逐渐加重,并出现轻度糜烂、结痂,于停药后5~10d皮肤恢复正常,皮肤刺激反应平均评分值为6.25,皮肤刺激强度评价为强刺激性。0.5%鬼臼毒素酊剂破损皮肤组豚鼠于给药后的1d内皮肤破损区及其周围即出现红斑、水肿,此后范围增大、程度加重,并出现破损区创面不愈合及部分皮肤坏死、结痂,于停药后7~14d皮肤恢复正常,皮肤刺激反应平均评分值为7.0,皮肤刺激强度评价为强刺激性。试验结果说明:在有效观察时间内,多次给予0.5%鬼臼毒素-固体脂质纳米粒对豚鼠皮肤均无刺激性。多次给予0.5%鬼臼毒素酊剂对豚鼠完整皮肤、破损皮肤均有较强的刺激性,其中破损皮肤组豚鼠皮肤刺激性出现的最早和最严重。2.3大鼠皮肤急性毒性试验结果单次大剂量给予受试物后,2周内各组大鼠均无死亡现象。给予0.5%鬼臼毒素-固体脂质纳米粒混悬液的完整和破损皮肤组大鼠及给予0.5%鬼臼毒素酊剂的完整和破损皮肤组大鼠,分别于给药后的前3,8,4,10d出现体质量减轻、食欲下降、反应迟钝、粪便色浅及活动减少,尤以皮肤破损组表现较明显,以后逐渐恢复。观察结束时0.5%鬼臼毒素-固体脂质纳米粒皮肤破损组、0.5%鬼臼毒素酊剂皮肤破损组大鼠体质量增长与正常对照组比较差异具有显著性(表1),而其他各组观察指标未见异常。试验结果说明:在一定观察时间内,0.5%鬼臼毒素-固体脂质纳米粒和0.5%鬼臼毒素酊剂单次大剂量应用时大鼠容易出现短期的系统吸收毒性,尤以皮肤破损组症状较明显,其中0.5%鬼臼毒素酊剂组大鼠出现中毒症状均较0.5%鬼臼毒素-固体脂质纳米粒组持久。2.4大鼠clsm扫描结果主要表现为每日给予小剂量受试物连续30d后,各组大鼠均未见动物死亡,末次给药后24h血液学、血液生化学检查结果各组间差异均无显著性意义(P>0.05)。0.5%鬼臼毒素-固体脂质纳米粒两组大鼠:(1)给药后的18~25d,均出现轻度的皮肤红斑、水肿、糜烂和结痂等炎症反应及局部毛发生长稀疏、缓慢或无毛发生长。(2)皮肤组织病理学检查可见表皮全层或部分变性、坏死,大量中性粒细胞浸润,真皮、皮下组织及毛囊结构完整,有轻、中度中性粒细胞浸润和部分毛细血管内皮细胞肿胀。(3)CLSM扫描可见以红色荧光显像的药物主要富集于表皮层及毛囊,而真皮及皮下组织药物含量相对较少(图1)。(4)其余各项观察指标与正常对照组比较均未见明显异常。0.5%鬼臼毒素酊剂两组大鼠:(1)给药后的4~7d,均出现轻度的皮肤红斑、水肿,随用药时间延长,炎症反应逐渐加重,并出现严重糜烂、结痂及皮肤坏死,毛发生长障碍较0.5%鬼臼毒素-固体脂质纳米粒两组更明显、更广泛。(2)皮肤组织病理学检查可见表皮全层坏死,真皮、皮下组织、毛囊及其周围部分变性、坏死,有大量中性粒细胞浸润,部分毛细血管内皮细胞变性,血管内可见微血栓形成。(3)CLSM扫描可见表皮全层坏死,以红色荧光显像的药物主要富集于真皮、毛囊及其周围,荧光强度相对较0.5%鬼臼毒素-固体脂质纳米粒两组强,皮下组织也可见较多药物荧光(图2)。(4)其余各项观察指标与正常对照组比较均未见明显异常。试验结果说明:(1)在一定观察时间和药物浓度范围内,小剂量长期应用0.5%鬼臼毒素-固体脂质纳米粒和鬼臼毒素酊剂对大鼠比较安全无系统吸收毒性。(2)应用0.5%鬼臼毒素-固体脂质纳米粒时大鼠可出现轻度以表皮为主的皮肤急性炎症反应并可有毛发生长障碍。(3)应用0.5%鬼臼毒素酊剂时大鼠可出现重度皮肤全层急性炎症反应及明显毛发生长障碍。(4)鬼臼毒素-固体脂质纳米粒组大鼠药物主要富集于表皮层和毛囊及其周围而真皮及皮下组织药物含量相对较少,较鬼臼毒素酊剂组具有良好的皮肤靶向性。3大鼠皮肤急性毒性试验结果由于0.5%鬼臼毒素酊剂常出现与表皮腐蚀有关的轻度皮肤灼痛、触痛,甚至疣体广泛坏死引起的剧痛通常男性阴茎湿疣一次应用0.5%鬼臼毒素酊剂的剂量小于70μL实验中,未观察到鬼臼毒素-固体脂质纳米粒对豚鼠皮肤有刺激反应,考虑可能与鬼臼毒素被固体脂质纳米粒包裹后,避免或减少了其与皮肤直接接触而致缺乏皮肤刺激或刺激强度不足有关。在大鼠皮肤急性毒性试验中,皮肤破损组大鼠容易出现较早、较明显的系统中毒症状,且0.5%鬼臼毒素酊剂组大鼠中毒症状持续时间均