大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

大肠杆菌感受态细胞的制备及转化大肠杆菌感受态细胞的制备及转化第1页试验原理试验仪器试验试剂试验步骤注意事项大肠杆菌感受态细胞的制备及转化第2页试验原理

电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰凉超纯水屡次洗涤处于对数生长前期细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽可能少导电离子。转化效率为109～1010转化子/µgDNA。热激法是利用冰凉CaCl2处理对数生长久细胞，能够诱导其产生短暂“感受态”，易于摄取外源DNA。转化效率为106～107转化子/µgDNA。大肠杆菌感受态细胞的制备及转化第3页试验仪器1．超净工作台2．低温离心机3．恒温摇床4．恒温培养箱5．-70℃冰箱6．制冰机7．移液器50ul、200ul、1000ul大肠杆菌感受态细胞的制备及转化第4页试验试剂１．氨苄（母液50mg/ml，终浓度为50ug/ml）：

2ml母液需氨苄100mg２．CaCl2(终浓度20mM)：需贮液1M、20ml，需

CaCl2固体4g３．MgCl2(终浓度80mM)：需贮液1M40ml，需

MgCl2固体4g４．甘油：500ml大肠杆菌感受态细胞的制备及转化第5页试验步骤CaCl2感受态细胞制备试验步骤电转化法制备大肠杆菌感受态细胞试验步骤大肠杆菌感受态细胞的制备及转化第6页CaCl2感受态细胞制备试验步骤

1．前夜接种受体菌（DH5

或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中

37℃摇床培养过夜（约16小时）；2．取1ml过夜培养物转接于100mlLB培养基中，在37℃摇床上猛烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；3．将0.1MCaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作；4．吸收1.5ml培养好菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；6．弃去上清，加入100

l预冷0.1MCaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；7．4℃下3000g冷冻离心5分钟；8．弃去上清，加入100

l预冷0.1MCaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9．细胞悬浮液可马上用于转化试验或添加冷冻保护剂（15%-20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。大肠杆菌感受态细胞的制备及转化第7页电转化法制备大肠杆菌感受态细胞

试验步骤

1．前夜接种受体菌（DH5

或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜；

2．取2ml过夜培养物转接于200mlLB培养基中，在37℃摇床上猛烈振荡培养至OD600＝0.6（约2.5-3小时）；

3．将菌液快速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作；

4．吸收1.5ml培养好菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；

5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；

6．弃去上清，加入1500

l冰凉10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；

7．4℃下3000g冷冻离心5分钟

8．弃去上清，加入750

l冰凉10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；

9．4℃下3000g冷冻离心5分钟10．加入20

l冰凉10%甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；11．马上使用或快速置于-70ºC超低温保留。大肠杆菌感受态细胞的制备及转化第8页注意事项1．细菌生长状态：试验中应亲密注视细菌生长状态和密度，尽可能使用对数生长久细胞（普通经过检测OD600来控制。DH5

菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）；2．全部操作均应在无菌条件和冰上进行；3．经CaCl2处理细胞，在低温条件下，一定时间内转化率随时间推移而增加，24小时到达最高，之后转化率再下降（这是因为总活菌数随时间延长而降低造成）；4．化合物及无机离子影响：在Ca2+基础上联合其它二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提升（100-1000倍）；5．所使用器皿必须洁净。迹量去污剂