基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入

基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第1页目标基因克隆三大战略：1.利用PCR技术或化学合成法体外直接合成目标基因，然后将之克隆、表示；2.构建感兴趣生物个体基因组文库或cDNA文库；3.利用基因差异表示取得目标基因。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第2页基因分离和取得常见方法一、基因分离物理方法二、鸟枪法(Shotgun)又称霰弹法三、cDNA文库建立与基因分离四、基因组文库法五、基因化学合成六、聚合酶链反应技术（PCR）基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第3页一、基因分离物理方法

依据DNA分子两条链存在着G≡C，A=T碱基配对。如DNA分子中某段G≡C碱基对含量高，则其热稳定性就高，其溶解温度（Tm）就高。这么，大家经过控制溶解温度使富A=T区解链变性，而富G≡C区仍维持双链。当利用单链核酸酶S，酶去除解开单链个别，得到富G≡C区DNA片段。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第4页二、鸟枪法(Shotgun)又称霰弹法

用限制性内切酶将基因组DNA进行切割，得到很多在长度上与普通基因大小相当DNA片段（1000bp），然后，将这些片段混合物随机地重组入适当载体，转化后在受体菌（如：E.Coli）中进行扩增，再用适当筛选方法筛选出你所要基因。优点：操作简单，命中率较高。缺点：盲目性大，阳性片段不一定恰好是基因，样本多，可能会漏。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第5页鸟枪法克隆目标基因基础战略1、随机酶切成基因相当大小片段（约1000bp)；2、重组入适当载体（质粒）；3、转化进宿主菌（E.coli)，扩增；4、筛选出含有目标基因目标重组子，进而取得目标基因。鸟枪法适合用于原核细菌目标基因克隆分离

+基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第6页三、基因文库法cDNA文库（cDNAlibrary)则是将某生物特定组织器官或发育时期全部mRNA反转录成cDNA，并全部克隆成重组子，在该重组子群集中包含了其全部表示基因产物。基因组文库(Genomiclibrary)是将某一生物基因组DNA全部克隆后取得重组子群体总称。基因文库(Genelibrary)是经过克隆方法保留在适当宿主中某种生物、组织、器官或细胞类型全部DNA片段而组成克隆集合体。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第7页构建基因文库意义

1.经过基因文库构建贮存和扩增特定生物基因组全部或个别片段，保留物种遗传种质。2.从基因文库中调出其中任何DNA片段或目标基因。3.构建基因文库是研究基因本身需要,如基因结构分析、基因表示和调控研究等。基因组文库类型:

质粒文库、噬菌体载体文库、粘粒文库、细菌人工染色体文库和酵母人工染色体文库。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第8页几个物种基因组大小及基因数目物种基因组大小（

106bp）基因数目衣原体（M.genitalium）0.58470大肠杆菌（E.coli）4.64288酵母（S.cerevisiae）13.56034果蝇（D.melanogaster）16513600线虫（C.elegans）9719099拟南芥（A.thaliana）13525500人（H.sapines）330035000基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第9页构建基因组文库应满足条件

基因组文库完备性：是从基因组文库中筛选出含有某一目标基因重组克隆概率。基因组文库大小:1）基因组大小；

2）克隆片断长度；

3）从中分离特定基因置信度。

N=1n(1一P)／ln[1-L/G]

式中P为期望概率，L为单个重组体DNA片段长度，G为基因组DNA总长度。N是所需要重组体数目

基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第10页比如，某一哺乳动物基因组G=3x109bp，以17kb随机片段克隆构建文库中，使任一给定DNA序列达99％概率出现，则：

N＝ln(1-0.99)／ln[1一(17x103／3x109)=8.1x105

假如克隆片断长为20kb，则N=6.5X105果蝇基因组约1.5X108bp，以20kb克隆时，N=4X105

基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第11页基因组文库构建

(一）基因组DNA分离制备原核细胞基因组包含其拟核DNA和附加遗传体系如质粒DNA，真核细胞基因组包含其核基因组及细胞器如线粒体和叶绿体DNA。质量必须满足：1.结构含有相对完整性；2.尽可能排除其它大分子成份污染(蛋白质、多糖及RNA等)；3.确保提取样品中不含对酶有抑制作用有机溶剂及离子等。

基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第12页（二）基因组DNA片段化1.限制性内切酶对DNA分子酶解两种方式：DNA完全酶解和DNA不完全酶解。DNA完全酶解人基因组DNA酶解琼脂糖凝胶M：DNA分子marker；1：未酶解人基因组DNA；2：RsaI完全酶解后DNAM12基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第13页DNA不完全酶解人基因组DNA以Sau3A酶进行不完全酶解M：DNA分子marker；1：未酶解基因组DNA；2-10：显示酶解程度逐步提升M12345678910基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第14页用DNA随机片断克隆法来：机械剪切和个别酶切1)

随机片断重合性，能够沿某一克隆“步查”直至将整个染色体衔接起来（利用片段间重合区信息，能够将独立重组子加以衔接，最终整个染色体次序连续出来：染色体步查）。

2)无须预知靶序列内部及其周围限制酶切位点而仍能够分离DNA片段。

3)文库规模减小。因为经过挑选而用于克隆DNA片段大，形成一个哺乳动物基因组DNA文库所需重组体数目显著降低。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第15页基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第16页基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第17页DNA分子物理剪切

利用识别4对碱基限制性内切酶制备随机性DNA片断，含有了较高随机性，但相对随机性更高方式还是利用不依赖碱基序列物理剪切方法。DNA分子物理剪切能够采取DNA溶液小孔喷射、超声波处理和高速搅拌等几个方式。

基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第18页选择适当构建基因组文库载体：

1）要求有较大克隆容量；

2）要求在置于宿主中扩增时有较高而均等转化效率；

3）在重组子进行扩增时，扩增机会相近；

4）能够较方便地进行文库筛选。基因组文库构建常见载体：Lambda噬菌体载体、cosmid、BAC及YAC。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第19页（三）载体制备

替换型载体进行基因文库构建示意图基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第20页基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第21页（四）重组连接制备出适当大小随机性基因组DNA与载体左臂右臂进行连接，实现左臂—插入分子—右臂分子重组。构建文库时重组连接常采取相同粘性末端连接，以

替换型载体构建基因组文库多采取BamHI酶切末端与插入外源DNASau3AI末端互补连接。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第22页（五）噬菌体离体包装：

宿主菌蛋白支架状前头部前头部A蛋白结合在基因组共聚体cos位点尾部成熟噬菌体头部功效

噬菌体自组装及DNA包装过程基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第23页（六）重组噬菌体转染大肠杆菌

噬菌体包装物在宿主大肠杆菌菌苔上检验效价及形成噬菌斑基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第24页其它载体文库构建1.粘粒载体文库基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第25页2.酵母人工染色体文库（yeastartificialchromosome,YAC）:基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第26页YAC含有酵母染色体自主复制序列、着丝点(centromere)、四膜虫端粒（telesome以及酵母选择标识基因组成能自我复制克隆载体。并带有大肠杆菌质粒载体复制元件和选择标识。酵母选择标识基因：色氨酸合成酶基因（TRP1），组氨酸合成酶基因（HIS4），尿嘧啶合成酶基因（URA3），赭石突变校正基因（SUP4）。YAC载体以环状方式存在，可插入长度达100-kb外源DNA。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第27页

与YAC载体配套工作宿主酵母菌带有一个赭石突变ade2。带有这个突变酵母菌在基础培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因sup4载体存在于细胞中时，可抑制ade2-1基因突变效应，形成正常白色菌落。无义突变：因为一对或几对碱基正确改变而使决定某一氨基酸密码子变成一个终止密码子基因突变叫无义突变。其中密码子改变为UAG无义突变又叫琥珀突变，密码子改变成UAA无义突变又叫赭石突变。

基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第28页细菌人工染色体（BacterialArtificialChromosomesBAC）

细菌人工染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒基础上构建，命名为pBACs，其装载量范围在50-300kb之间。携带一个Cmr，严谨型复制子oriS,解旋酶基因repE,

确保低拷贝质粒准确分配至子代细胞基因座parA,parB,parC及多克隆位点基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第29页重组分子导入受体细胞

以Lambda噬菌体载体和cosmid载体构建重组分子在体外包装成噬菌体颗粒，经过感染细菌方式将重组分子导入受体细胞。以酵母人工染色体和细菌人工染色体载体构建重组分子采取电激转化法将重组分子导入受体细胞。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第30页基因组文库扩增筛选

1.文库扩增

lambda载体基因组文库是以噬菌斑形式取得重组噬菌体集合；

cosmid载体基因文库是存在于细菌中大分子重组质粒，以独立转化菌落形成集合；BAC文库也是以细菌菌落形式存在；

YAC文库则以酵母菌形式出现。噬菌体文库扩增能够经过感染宿主，每一噬菌斑便是一个重组噬菌体扩增后产物。用缓冲液将这些噬菌斑中病毒洗脱下来，便取得了扩增后文库。离心除出细菌碎片等杂质后，上清液加1-2滴氯仿，置于40C能够保留数年。

粘粒载体、BAC和YAC文库，则对转化菌落单独编号、扩增和保留。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第31页2.文库筛选硝酸纤维素膜或尼龙膜放射性标识探针进行文库杂交筛选基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第32页染色体步移(chromosomewalking)

当基因位置已知，但没有可用探针，只知道同一染色体上另外一个已经克隆基因，就能够经过染色体步移方法克隆所需基因。

其基础原理是用探针筛选文库，得到阳性克隆后，将这个重组载体中插入片段分离出来，然后用这个片段末端个别(注意不能包含重复序列)作为新一轮筛查文库探针；得到新重组载体中插入片段，同上一个插入片段末端个别(即探针序列)是重合，共有。也就是这两个片段是在同一条染色体上相互邻接。于是，再用新得插入片段末端个别作为探针，再去筛选文库。经过一系列操作，得到插入片段逐步连接延伸，最终能够步移到待克隆基因。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第33页

其基础策略是依据已知基因片段末端序列合成探针，重复进行基因文库筛选，知道满足需要为止。

染色体步移是一项复杂、繁琐技术，到当前为止，步移最大距离时200-250kb。然而成功报道很多，如人类囊肿性纤维化疾病基因。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第34页cDNA文库优越性：1

cDNA克隆以mRNA为材料，尤其适合用于一些RNA病毒，比如流感病毒、脊髓灰质炎病毒和呼肠孤病毒等基因组结构研究及相关基因克隆分离。2

cDNA基因文库筛选比较简单易行。 3．每一个cDNA克隆对应于一个mRNA序列，假阳性概率就会比较低，所以阳性杂交信号普通都是有意义，由此选择出来阳性克隆将会含有目标基因序列。4．cDNA克隆可用于在细菌中表示基因产物。

cDNA文库构建与筛选基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第35页

cDNA文库大小：cDNA基因文库大小估算公式

N=ln(l-P)/ln(l-f)N为cDNA基因文库必需克隆数目；P为文库中含目标基因cDNA片段出现概率，普通情况下，期望值为99%；f是某种mRNA丰度。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第36页

cDNA文库

用细胞总mRNA制备全套双链cDNA后，建立基因文库。简称c－文库。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第37页

cDNA文库构建：1.cDNA文库构建载体cDNA是由mRNA反转录取得互补DNA，分子大小通常分布在0.5kb—10kb间。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第38页

2.cDNA取得

a.分离mRNA

分离总体RNA：利用guanidinethiocyanate（异硫氰酸胍）ß-mercaptoethanol（ß-巯基乙醇）使核糖体解体，而染色体不发生解体，再采取苯酚-氯仿抽提和乙醇沉淀，取得RNA。利用mRNA分子3‘端都含有一段由20-250个多聚腺核苷酸组成poly(A)尾巴将mRNA从细胞总RNA混合物中分离出来。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第39页GIT与β－巯基乙醇共同作用抑制RNase活性；GIT与十二烷基肌氨酸钠（Sarcosyl）作用使蛋白质变性，从而释放RNA；酸性条件下DNA极少发生解离，同蛋白质一起变性被离心下来，RNA则溶于上清中。该法所提RNA纯度高完整性好较适合纯化mRNA，逆转录及构建cDNA文库，所以为大多数人采取。与氯化铯方法比较，即使纯度稍差一些，小分子RNA，如tRNA、snRNA不易去除，但产量高完整性好，盐易去除。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第40页

基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第41页b.对mRNA进行富集已知要分离目标基因mRNA分子大小，经过凝胶电泳或蔗糖密度梯度离心，回收与目标基因mRNA分子大小相近mRNA。分离未知分子大小目标基因cDNA,则可把最初制备总mRNA先经过蔗糖密度梯度离心或凝胶电泳，按mRNA分子大小分部回收mRNA。随即将每个分部回收mRNA进行体外转译，并结合使用免疫沉淀和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技木，判定出目标基因蛋白质产物。再以此分部mRNA构建cDNA基因文库。经过离心和电泳分个别离，能够使低丰度mRNA得以富集。细胞中mRNA依据其在细胞中拷贝数，可分为两大类：一类为高丰度mRNA，通常有100种左右不一样mRNA，每种mRNA拷贝数在1,000至10,000间；另一类为低丰度mRNA，包含约10,000种mRNA每种拷贝数在1至10间。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第42页c.cDNA合成

cDNA第一链合成是以mRNA分子为模板，在逆转录酶作用下，利用适当引物引导合成。常见方法有，即oligo-(dT)引导cDNA合成法和随机引物引导cDNA合成法。oligo-(dT)引导cDNA合成法是利用12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成oligo-(dT)短片段作为引物，在逆转录酶作用下，以mRNA为模板合成第一链cDNA，形成RNA-DNA杂交分子。

基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第43页cDNA法克隆目标基因基础战略mDNAcDNA第一链合成

5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’5‘ppp’5G

G

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3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’5‘ppp’5G

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3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’cDNA第一链引物退火逆转录酶dNTPs基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第44页cDNA第二链合成

煮沸NaOH本身引导法：取得双链cDNA5’端会有几对碱基缺失AAAAAAAAAAAAAA5‘ppp’5G

G

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3’TTTTTTTTTTTTTTp

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3’TTTTTTTTTTTTTTOH

3’KlenowdNTPsS1基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第45页cDNA第二链合成

DNApoldNTPsRNaesH置换合成法：取得双链cDNA5’端也会有几对碱基缺失5‘ppp’5G

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3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’5’TTTTTTTTTTTTTTOH

3’AAAAAAAAAAAAAA5’5’TTTTTTTTTTTTTT3’3’T4-DNAligase基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第46页cDNA第二链合成

dCTP引导合成法：取得双链cDNA能保留完整5’端序列5‘ppp’5G

G

AAAAAOH

3’TTTTTp

5’3‘

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HOCCCCCCCTTTTTp

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5’5‘

pGGGGGGGAAAAAOH

3’NaOH退火KlenowdNTPs基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第47页双链平头cDNA通常克隆入载体中三种方法：平头末端直接与载体连接，但插入片段无法回收平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这么重组分子可经过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段加装人工接头引入酶切口，方便插入片段回收d.粘性末端片断与载体连接基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第48页人工接头法克隆cDNA入

插入型载体基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第49页e.离体包装取得重组噬菌体

基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第50页文库筛选：筛选文库即指从文库克隆群体中将特定克隆选择出来过程。分离基因依据：依据目标基因一些或某个特征来进行克隆筛选及基因分离。对于编码产物已知目标基因：

1.能够依据蛋白质氨基酸序列推导出核苷酸序列，并以该核苷酸序列作为探针进行直接分离。2.能够应用特定蛋白质抗体及蛋白质功效测定来筛选对应目标基因。编码产物未知目标基因：需要用特殊分离伎俩(诸如差异显示技术、差异杂交方法等)取得探针，然后再深入从基因文库中分离得到目标基因。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第51页利用简并探针筛选cDNA文库1.利用氨基酸序列信息进行cDNA文库筛选基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第52页利用简并探针筛选cDNA文库基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第53页利用标识抗体对cDNA文库进行筛选2.利用标识抗体对cDNA文库进行筛选基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第54页

3.分子探针杂交方法，经过分子杂交后信号，将与探针特异结合克隆钓取出来。噬菌斑吸印与杂交基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第55页利用差异杂交方法对文库进行筛选

基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第56页4.利用PCR方法进行cDNA文库筛选基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第57页基因组文库与鸟枪法不一样点1、克隆DNA片段较大（10~30Kb，平均20Kb)，而鸟枪法为1000bp;2、能够覆盖宿主DNA全部序列；3、DNA片段要进行分离：分离方法如：蔗糖密度梯度离心凝胶电泳4、载体不一样。基因组文库法为噬菌体，而鸟枪法为质粒。值得注意是，从基因组文库所分离取得基因序列包含有内含子，所以不能直接在原核细胞中表示，但更适合作为如转基因动物等真核表示系统。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第58页四、基因化学合成伴随寡核苷酸化学合成自动化，基因化学合成变得更经济、轻易和准确。前提条件：对基因结构序列清楚。分为：基因片段全化学合成基因化学—酶促合成基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第59页化学合成单元操作HHDMT：二甲氧基三苯甲基OHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeH激活缩合氧化脱取代基玻璃珠连接臂基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第60页基因片段全化学合成混合退火依据目标基因全序列，分别合成正负链单链DNA片段T4-DNA连接酶连接克隆入适当载体

基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第61页基因化学——酶促合成混合退火依据目标基因全序列，分别合成单链DNA片段T4-DNA连接酶连接克隆入适当载体

Klenow酶聚合基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第62页全长基因合成化学合成目标基因前提条件是基因DNA序列已知，有三种战略：依据目标基因全序列，分别合成12-15碱基长单链DNA小片段。小片段粘接法：

混合退火T4-DNA连接酶连接克隆入适当载体

基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第63页补钉延长法：

混合退火依据目标基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长单链DNA小片段以及20-30碱基长单链DNA中片段T4-DNA连接酶连接克隆入适当载体

Klenow酶聚合基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第64页基因化学合成优点1、能够合成细菌偏爱密码子2、能够定向改变个别氨基酸3、能够在两端加上需要限制酶切点4、能够经过自动化仪器合成基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第65页

上述三种方法各有利弊：化学合成DNA单片段愈短，收率就愈高，但因为化学合成份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目标基因时，即使化学合成份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成收率极低，比如，每聚合一个单体产物收率为95%则合成50个碱基长DNA单链大片段总收率只有7.7%基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第66页五、聚合酶链反应技术（PCR）定义：聚合酶链反应技术是指在四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）存在下，以寡聚核苷酸为引物，以单链DNA为模板，经DNA聚合酶催化，合成DNA互补链到达基因扩增目标过程。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第67页PCR技术反应周期包含三个步骤：1、高温变性：经过加热使得复制双螺旋DNA变性分离为单链，作为模板。（>91℃，1分钟）。2、低温退火：（约50℃，1分钟）使专门设计一对寡核苷酸引物在此低温条件下分别与单链模板DNA两端互补区段互补结合。3、适温延伸：将反应混合物温度上升到72℃，保温1分钟。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第68页基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第69页PCR原理图

基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第70页PCR反应必要条件：须知基因两端个别序列PCR反应中几个关键原因1、TaqDNA聚合酶2、引物长度3、模板4、Mg浓度5、温度循环参数PCR反应优点：1、操作简单2、通用性好3、成功率高PCR主要参数确定：退火温度Mg2+

反应时间循环次数基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第71页RE1RE2Sequencing已知靶序列扩增侧翼序列PCR常规PCR衍生几个基因克隆技术（一）反向PCR(inversePCR)基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第72页（二）热不对称交织PCR(thermalasymmetricinterlacedPCR,TAIL-PCR)简并引物是指用来编码一段短肽序列不一样碱基序列混合物。

原理：依据目标序列侧翼已知序列设计３个嵌套特异引物（sp1,sp2,sp3,约20bp），用它们分别和一个含有低Tm值短随机简并引物（arbitrarydegenerateprimer,AD,约14bp)相结合，以基因组为模板，依据引物长度及特异性差异设计不对称温度循环，经过分级反应来扩增特异引物。TAIL-PCR分三轮反应基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第73页基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第74页（1）提取基因组totalRNA（2）反转录合成总cDNA作模板（4）PCR扩增（3）依据目标基因序列设计引物(三）从mRNA中扩增:RT-PCR原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。适合扩增真核生物基因。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第75页目标基因引物1反转录成目标基因cDNA第一链目标基因引物2目标基因cDNA第二链PCRmRNA基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第76页（四）锚定PCR（五）cDNA末端快速扩增cDNA末端快速扩增（rapidamplificationofcDNAends,RACE）是克隆目标基因cDNA一个常见方法。这种方法依据基因编码蛋白同源性或者多个同源基因cDNA比较变异情况，将同源性基因cDNA关键区段分析出来，针对关键区段保守性高位点设计引物，然后利用RT-PCR先扩增和克隆关键序列区。在测定关键序列后，依据关键序列设计新引物并分别进行cDNA3

端和5

端扩增。最终拼凑成cDNA全序列信息并设计新一对引物将其RT-PCR扩增并克隆。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第77页RACE示意图

基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第78页利用oligo(dT)引物反转录cDNA第一链后，以关键区段引物扩增出中间关键片段，测序后能够设计出3

RACE上游引物和5

下游引物，3

端上游引物结合oligo(dT)下游引物将cDNA3

端克隆出来。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第79页1.分析关键区段利用已克隆人和果蝇基因资料，克隆蚊子胰蛋白酶基因cDNA。先比较人和果蝇胰蛋白酶氨基酸序列同源性.2.设计简并引物和扩增关键区段

氨基酸序列

W(Trp)V(Val)L(Leu)T(Thr)A(Ala)

密码子

UGGGTTTTAACTGCT

CGCCACTTAAGCGGGA基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第80页3.设计RACE引物扩增关键区段克隆和测序后，即取得了目标基因中间个别序列，依据这一序列分别设计3

RACE上游引物和5

RACE下游引物。4.3

端RACEcDNA3

快速克隆比较简单，依据中间关键序列设计出3

端RACE上游引物后，利用oligo(dT)作为下游引物，利用mRNA反转录体系作为模板，PCR在两引物间将cDNA3

端扩增出来。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第81页5.5

端RACE5

端RACE时，尽管其下游引物依据克隆关键序列能够确定下来，但因为5

端上游序列还未知，上游引物难以确定，因而5

RACE要采取一些特殊方法确定其上游引物位点。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第82页BD企业SMARTcDNA5

端RACE试剂盒原理图基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第83页在反转录酶（RT）作用下，利用Oligo(dT)作引物合成cDNA第一链，RT在cDNA第一链末端延伸合成了几个C碱基，体系中加入3

端为G碱基寡聚序列与cDNA末端互补，作为cDNA继续延伸合成模板，在cDNA末端合成出一段已知序列，形成5

RACE引物位点。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第84页五、依据基因差异表示取得目标基因1.差异显示PCR（DD-PCR）差异显示技术原理和试验程序:

1992年，Liang和Pardee首次提出差异显示技术(DD-PCR)，其基础原理是，利用一系列oligo(dT)引物，逆转录真核生物细胞中全部表示mRNA，经过PCR扩增方法，转换成cDNA双链，再利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将有差异片段分开，筛选出目标基因。其技术普通包含以下步骤：(1)从植物组织中提取总RNA，在这个步骤中注意不能有DNA污染，普通用无RNA酶DNA酶在37℃下处理30min；基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第85页(2)在逆转录酶作用下，以Oligo(dTMN)为引物(M为G、A、C中任一个，N为A、C、G、T任一个)，进行逆转录；(3)PCR反应，扩增cDNA第一条链；(4)扩增后cDNA进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，使差异表示cDNA片段在6%测序胶上分开；(5)找出不一样处理间差异显示条带，从胶上切割下来，并回收，再进行第二次扩增；(6)克隆差异片段，差异片段可作为探针；(7)Northern杂交，验证目标片段，去掉假阳性片段；(8)对目标片段进行测序；(9)以克隆目标片段为探针，从基因组文库中筛选出对应全长基因。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第86页DD-PCR法含有快速、灵敏、简单和可分析低丰度mRMA优点已为植物基因表示研究和基因克隆所证实。但也有一些缺点，如扩增片段短、假阳性高、检测全部mRMA工作量大、基因克隆受mRMA表示时效性影响等。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第87页DD-PCR技术流程基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第88页2.mRNA差异显示PCR（DDRT-PCR）mRNAdifferentialdisplayRT-PCR（1）3’端锚定引物Oligo(dT)引物3’端加两个核苷酸（倒数第二个不再是T）。

AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3’

5’

NMTTTTTTTTM：A、GorCN:A、G、TorC5’

3’

基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第89页（2）12种锚定引物AGTTTTTTTT5’

3’

CGTTTTTTTT5’

3’

GGTTTTTTTT5’

3’

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3’

AATTTTTTTT5’

3’

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3’

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3’

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3’

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3’

CCTTTTTTTT5’

3’

GCTTTTTTTT5’

3’

TCTTTTTTTT5’

3’

基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第90页（3）5’端随机引物10mer

AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3’

5’

NMTTTTTTTT5’

3’

扩增cDNA第一链。RTNMTTTTTTTT5’

cDNA3’

NNNNNNNNNN5’

3’

NNNNNNNNNN5’

3’

cDNA第二链，并PCR基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第91页（4）随机引物与锚定引物成对扩增12种锚定引物，若与20种随机引物，可组成240组引物。引物组合：240组在能分出0多条带！试验结果：假如每条带相当于一个mRNA，0mRNA基础上反应了一个特定细胞中全部mRNA。在测序胶上，每组扩出50-100条长度为100-500bp带。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第92页（5）随机-锚定引物PCR产物电泳比较不一样组织240组引物组合PCR产物在测序胶中电泳。选择有差异带，深入PCR作探针。筛选文库，找到差异基因全长序列。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第93页3.代表性差异分析此法是由Hubank和Schatz1994年提出。将合成cDNA酶切，经过降低cDNA群体复杂度和屡次更换cDNA两端接头等方法，特异扩增目标基因片段，重复性好，假阳性低。其主要步骤是，提取总RMA，逆转录合成cDNA，用识别4个碱基限制性内切酶消化，连接接头，扩增出不一样代表子，进行Tester与Driver杂交，消减杂交富集，从而找出差异cDNA片段。

基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第94页SchematicdiagramofimprovedcDNArepresentationaldifferenceanalysis(RDA)procedure基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第95页BasicstrategyforcDNA-basedrepresentationaldifferenceanalysis.基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第96页第五节重组DNA向宿主细胞内转移技术因为外源基因与载体组成重组DNA分子性质不一样、宿主细胞不一样，将重组DNA导入宿主细胞详细方法也不相同。转化：是指微生物细胞直接吸收外源DNA过程。是使重组体DNA分子在热休克短暂时间内被导入受体。热休克后将受体菌在不含抗生素培养液中生长最少30分钟以上，使其蛋白得到足够表示，方便能在含抗生素琼脂培养平板上生长。因为E.coliX1776菌株用CaCl2处理后制备感受态细胞长久冷藏仍能保持其摄取外源DNA能力，故常见作受体菌。转染：是指噬菌体、病毒、或以其为载体构建重组DNA导入细胞过程。(其中又分磷酸钙沉淀法与体外包装法)转导：重组噬菌体DNA或重组粘粒DNA必须包装成完整噬菌体颗粒，经过温和噬菌体颗粒释放和感染将重组DNA转移至宿主内过程。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第97页重组DNA导入受体细胞路径转化：transfermation，经过生物学或理化方法使质粒DNA或以质粒DNA为载体构建重组DNA导入受体细胞内，并在受体内稳定维持和表示过程，主要用于原核生物。转染：transfection，是转化一个特殊形式，指病毒或以病毒为载体构建重组DNA导入受体细胞，并使宿主遗传性状发生改变过程，其中包含DNA、RT-DNA及RNAi，主要用于原核生物。转导:(transduction)以噬菌体作载体构建重组体导入受体细胞过程。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第98页1.直接转化法有微生物细胞在不加任何处理情况下就能直接摄取外源DNA，只要外源DNA与这么细胞混合，在适宜条件下悬浮培养，就能完成外源DNA转化。细菌转化：指一个细菌菌株因为捕捉了来自另一细菌菌株DNA，而造成性状特征发生遗传性改变生命过程。这种提供转化DNA菌株叫给体菌株，而接收转化DNA寄主菌株叫受体菌株。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第99页大肠杆菌是当前基因工程中最常见受体细胞。通常采取是大肠杆菌感受态细胞，即在冰浴中用一定浓度CaCl2处理对数生长久大肠杆菌，以取得高效转化感受态细胞。也有采取Rb+、Mn2+、K+、二甲亚矾、二硫苏糖醇(DTT)或用氯化己胺钴处理制备感受态细胞。感受态：是指受体细胞能吸收外源DNA分子而有效地作为转化受体一些生理状态。普通受体细胞在对数生长久转化能力最强。感受态细胞(competentcell):含有易于接收外源DNA能力细胞。基因工程中，宿主细胞需经人工处理成能吸收重组DNA分子敏感状态，才能用于转化，这种敏感细胞称为人工感受态细胞。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第100页感受态细胞制取普通是将细菌（如大肠杆菌等）用一定浓度冰凉CaCl2处理而得。1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞变为感受态细胞。

为了得到很好感受态细胞，需注意以下几点：1、细胞要处于对数生长久2、整个制备过程要在低温（0~4℃）进行3、为了提升转化率，可选取复合氯化钙溶液基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第101页操作程序：1处于对数生长久细菌置于0℃CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+使细胞磷脂层形成液晶结构，使得外膜与内膜间隙个别核酸酶离开所在区域，组成大肠杆菌人工诱导感受态；2加入DNA，Ca2+与DNA形成抗脱氧核糖核酸酶羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜外表面；3经短暂42℃热激处理后，细菌细胞膜液晶结构发生猛烈扰动，出现许多间隙，造成通透性增加，DNA分子进入细胞中。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第102页基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第103页2.化合物诱导转化法原理：外源DNA与多聚物（聚乙二醇(PEG)、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等）、二价阳离子（Mg、Ca、Mn等）混合，再与受体细胞或原生质体混合，可使外源DNA进入细胞。尤以PEG应用最广，可用于原核生物细胞、动物细胞和植物原生质体基因转化。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第104页PEG介导基因转化Davey1980年和Krens1985年首先建立。步骤转化培养：将制备原生质体悬浮液与重组DNA一起保温培养，同时加入PEG在pH8-9下促进原生质体摄取DNA，从而使细胞转化。通常使用PEG分子量3000左右。转化效率很低10-5—10-6基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第105页3.高压电穿孔转化法（1）Electroproration原理：利用高压电脉冲作用，使细胞膜上产生可逆瞬间通道，从而促进外源DNA和高分子物质进入细胞质内而实现基因转化，但不伤及细胞，切断电场后，被击穿膜孔能够自行恢复。当电场强度和脉冲时间结合造成50-70%细菌死亡时，转化水平最高。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第106页（2）过程：把宿主细胞置于外加电场中，经过电脉冲作用在细胞膜上打孔，DNA分子进入细胞。（3）条件：电压300~600V、时间20~100ms、温度0℃。（4）适用范围：酵母菌、霉菌等真核生物，适合用于农杆菌感染不敏感植物。（5）形式：电穿孔电穿孔+PEG。转化效率10-5—10-6，1.2%基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第107页比如：高压电穿孔法转化细菌对数生长久细菌冷却离心低盐缓冲液清洗用10%甘油悬浮细胞干冰速冻-70℃贮存使用期6W外加电场（300-600V维持20—100ms）电脉冲转化细胞0-4℃基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第108页4.微弹轰击转化法（microprojectilebombardment,particlebombardment）该法亦称基因枪法(particlegun)，粒子轰击法，生物弹法（Biolistics）。（1）原理：金属微粒在外力作用下，到达一定速度后，将包裹在金属颗粒表面外源DNA分子随金属颗粒一起进入植物细胞，但又不引发细胞致命伤害而维持正常生命活动。（2）过程：外源DNA与钨、金等金属微粒混合，使DNA吸附在微粒表面；用基因枪轰击，经过氦气冲击波使DNA随金属微粒进入植物细胞。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第109页（3）适用范围：植物细胞。（4）特点：操作简单，转化率高，省去了分离原生质体麻烦，耗资较大。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第110页DNA微粒载体制备原理是CaCl2对DNA沉淀作用，亚精胺、聚乙二醇含有粘附作用、将这些化合物与DNA混合后与钨粉或金粉混合，吹干后，则DNA沉淀在载体颗粒上基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第111页基因枪介导DNA转移基因枪法最早是由美国康奈尔大学Sanford(1987)最先提出。它经过高速飞行金属颗粒将包被其外目标基因直接导入到受体细胞内，从而实现基因转化方法。1992年，世界首例转基因小鼠就是经过该法取得。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第112页一类是以火药爆炸力作为动力加速微弹；第二类是以高压气体(highpressuregas)作为动力，如以氦气、氢气、氮气等。其工作原理是把载有DNA钨(金)粉喷洒在一张微粒载片上，电极间悬滴着微水滴。在压缩空气冲击下，微水滴雾状喷射，驱动载片。当载片受阻于金属筛网时,载有DNA钨(金)粒继续向下冲击射入细胞。第三类是以高压放电为驱动力。其最大优点是能够无级调速，经过改变工作电压，粒子速度及射入浓度可准确控制，使载有DNA钨(金)粉粒子能抵达含有再生能力细胞层。这一点非常主要，因为不一样外植体需要不一样参数。采取该放电轰击、已在大豆和水稻上成功地取得了转基因植株(Christou等，1992)

基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第113页基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第114页基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第115页5.显微注射法（microinjection）（1）原理：利用显微注射仪，经过机械方法把外源DNA直接注入细胞质或细胞核（需用特制玻璃微管）。倒置显微注射仪基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第116页基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第117页（2）过程：将外源基因直接注入试验动物受精卵原核，外源基因整合到动物基因组，经过胚胎移植把含有外源基因受精卵移植到受体子宫并发育。（3）适用范围：真核生物，早期用于动物，现已应用于植物。（4）特点：繁琐耗时、转化率高，但需专门显微注射仪，且要求操作者有精细操作技术和低密度细胞培养技术。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第118页受体细胞固定动物细胞含有独特贴壁生长待性，不存在固定细胞问题植物细胞必须先建立细胞固定技术当前有三种方法：①琼脂糖包埋法：把低熔点琼脂糖熔化，冷却到一定温度后将制备细胞悬浮液混合于琼脂糖中。需要注意问题是，在包埋时细胞约1/3-1/2暴露在琼脂糖表面，即细胞体二分之一埋在琼脂糖中，起固定作用，暴露二分之一细胞可一进行微针注射、不然琼脂固化后极难进行。②多聚-L-赖氨酸粘连法：先用多聚-L-赖氨酸处理玻片表面，因为聚赖氨酸对细胞有粘连作用，所以当分离细胞或原生质体与玻片接触时被固定在玻片上。而且一个破片上可固定较多数量细胞或原生质体。③吸管支持法：用一固定毛细管将原生质体或细胞吸着在管口起到固定作用，然后再用微针进行DNA注射。这种方法优点是吸管能够旋转或移动位置．使操作者能选择最正确位置进行注射。显微注射用微针通常见拉针机制备，尖针直径以0.5μm左右为宜。一次注入细胞质中DNA量约为10-9／ml。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第119页转化率及影响原因

显微注射即使操作繁琐耗时，但其转化效率很高已发展出一套完善技术，在烟草、油菜、苜蓿等植物原生质体转化率高达60％以上。影响转化率原因。(1)原生质体成活率是转化率主要原因，只有注射那些能够分裂、成活原生质体才能得到转化。所以，注射时要选择开启分裂、细胞壁开始形成原生质体进行注射。

(2)线性DNA比环形DNA含有更高转化率。

(3)操作要快速灵敏，选择最正确注射强力和浓度，使细胞损伤降低到最小程度。

(4)固定技术要可靠，不能损伤细胞。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第120页显微注射特点①方法简单、转化率高；6-8%②它是一个纯粹物理方法，适合用于各种植物和各种材料，无不足；③整个操作过程对受体细胞无药品等毒害，有利于转化细胞生长发育；④转化细胞培养过程无需特殊选择系统。缺点是需要有精细操作技术及低密度培养基础，注射速度慢、效率低，要求研究者有耐心。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第121页6.脂质体（liposome）介导法（1）原理：受体细胞细胞膜表面带负电荷，脂质体颗粒带正电荷，利用引力作用把遗传物质导入细胞内。即用脂类化学物质包裹DNA成球体，经过植物原生质体吞噬或融合作用把内含物转入受体细胞。脂质体是依据生物膜结构功效特征合成生物膜，然后把DNA包裹在人工膜内。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第122页基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第123页（2）过程：在形成脂质体时，把用来转染目标DNA分子包裹在其中；脂质体与细胞接触；外源DNA分子导入受体细胞。（3）适用范围：真核细胞。（4）特点：包在脂质体内DNA可免受细胞内核酸酶降解，所以可直接转化外源DNA；对植物病毒RNA转化率高；如用PEG诱导脂质体与原生质体融合可取得高转化率。4ⅹ10-5(5)影响脂质体转化率原因很多：①脂质体制备类型、方法都有显著差异；②PEG浓度、加入时间、PH值及ca”浓度均起到主要作用；③保温培养及转化时条件一样十分主要。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第124页7.花粉管通道法（1）原理：在花粉管通道形成之后封闭之前一段时间，使外源DNA能沿着花粉管通道进入胚囊，转化尚不具正常细胞壁卵细胞、合子或早期胚胎细胞，从而实现基因转移。（2）适用范围：植物基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第125页（3）特点：直接得到转化种子，不经过组培，降低了基因型影响；操作简单经济，无需昂贵仪器和化学药品，可直接在大田操作；大量快捷，性状稳定，转化率高；可取得1×10-2~1×10-1高遗传转化率。

不但能够导入供体总DNA，而且可导入含目标基因质粒，甚至可将化学诱变剂导入胚囊。缺点：工作时间受自然花期限制，田间操作受环境影响大，基因组以随机方式结合，要求工作人员经济性要强，工作效率较低。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第126页我国科学家周光宇在1983年首次在“MethodsinEn-zymology”报道研究结果。现该技术主要在蔬菜育种上应用。（白菜、茄子、黄瓜、番茄、辣椒等操作步骤:1.外源DNA制备2.分析受体植物受精过程及时间，确定导入外源DNA时间方法（3种）柱头涂抹法柱头切除法花粉粒吸入法3.后代材料处理基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第127页8.超声波介导转化法（1）原理：利用低音强脉冲超声波物理作用，可逆性击穿细胞膜并形成过膜通道，使外源DNA进入受体细胞。（2）特点：防止脉冲变电压对细胞损伤，有利于细胞存活整个操作转化率较高，如在转化反应中加入DMSO或携带DNA则转化率更高。60-70%（3）适用范围：微生物、植物基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第128页过程:无菌材料制备质粒DNA提取超声波缓冲液配置超声波处理（去无菌材料切成小块，放入无菌超声波小室，同时加入5%DMSO缓冲液，质粒DNA20ug/ml及鲑鱼精DNA40ug/ml，室温下超声波处理30min）处理后用缓冲液洗3次接种在MS或其它培养基上培养基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第129页9.激光微束穿孔转化法早在1984年Tao等首先利用激光微束对动物细胞进行DNA转化试验、此庸Web等利用激光微束技术对原生质体、花粉以及活细胞内叶绿体进行外源DNA导入取得成功，并用荧光标识大肠杆菌pBR322质粒DNA在转化细胞中得到检测。（1）原理：利用直径很小、能量很高激光微束能引发细胞膜可逆性穿孔原理。在荧光显微镜下找适合细胞，然后用激光代替荧光光源，聚焦后发出激光微束脉冲，造成膜穿孔外于细胞周围外源DNA分子随之进入受体细胞。（2）特点：操作简便快捷，转化效率高10-3-10-4，无宿主限制，但需要珍贵仪器，技术条件要求高，稳定性和安全性不如电穿孔法和基因枪法。（3）适用范围：动植物细胞、组织、器官及线粒体、叶绿体。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第130页过程1）DNA提取2)受体植物样品制备：将欲照射植物细胞或组织用高渗缓冲液浸泡数分钟，不一样作物不一样外植体所用高渗液不一样，浸泡时间也不一样。

3)转导细胞悬浮液准备：激光照射前洗去高渗液，加新鲜培养液。吸收0.5mI细胞悬浮液，加50ul质粒DNA或植物外源DNA(浓度5ug／ml)．一起注入激光微束系统Rose小室。4)激光微束照射：激光微束显微照射装置如为Nd—YAG四集倍频脉冲激光冠微照射系统、即输出波长技需要选择，脉宽10-15ns。激光束引入一台相差显微镜，用40ⅹ物镜聚焦Y于欲照射细胞。光斑直径为1.3nm。照射时移动载物台，使激光脉冲在植物细胞团上进行扫描照射，照射时间每个佯品60分钟，约打7000个脉冲。

5)培养：激光照射后，将样品用新鲜培养液冲洗1-2次，然后接种在装有液体培养基小培养皿中，25度条件下悬浮培养2-3天或固体培养。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第131页基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第132页10.病毒颗粒转导法（1）原理：用病毒(噬菌体)DNA(或RT-DNA)构建克隆载体或携带目标基因克隆体，在体外包装成病毒(噬菌体)颗粒后，感染受体细胞，使其携带重组DNA进入受体细胞，将此过程称为病毒(噬菌体)颗粒转导法。（2）适用范围：主要用于构建基因文库和目标转基因，早期也用于植物转基因。（3）类型：带有目标基因病毒颗粒直接感染受体细胞，目标基因打随同病毒DNA分子整合到受体细胞染色体DNA上，这么以后不需要再包装成病毒颗粒。带有目标基因病毒是缺点型，需同另一辅助病毒一起感染受体细胞，在受体细胞内包装成新病毒颗粒。即使带有目标基因SV40早期转录是缺点型，但被感染cos细胞系基因组中整合SV40早期转录区段DNA，所以无需辅助病毒做混合感染。基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入第133页11.磷酸钙转染法（1）原理：哺乳动物细胞能捕捉黏附在细胞表面DNA-磷酸钙沉淀物，使DNA转入细胞。（2）基础操作过程：将待转染外源DNA同CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液，逐滴加入到不停搅拌Hepers-磷酸钙溶液中，形成DNA-磷酸钙共沉淀复合物；用吸管将沉淀复合物黏附在哺乳动物单层培养细胞表面；保温几小时后，用新鲜培养液洗净细胞，再用新鲜培养茹继续培养，直至外源基因表示。（3）特点：多使用高浓度DNA，10~50µg/ml；保温时间随受体细胞而异；Hepers-磷酸钙溶液应不停搅拌，DNA溶液则应迟缓加入，不然形成大块状颗粒，不利于受体