益气温阳中药对心力衰竭大鼠心肌组织和成纤维细胞的影响

益气温阳中药对心力衰竭大鼠心肌组织和成纤维细胞的影响

心力衰竭（hf）是一种疾病的最终综合征，通常由心血管疾病的长期治疗而形成。其发病机制是基础研究的热点之一。从前对心衰理论的了解包括心与心，心与肾，与神经体液，随科研深入，逐渐发现细胞组织凋亡、能量代谢改变等多方面都是心衰的病理过程。人与动物的能量代谢主要是通过细胞内线粒体，提供绝大多数的维持生命的能量，相关研究显示，线粒体功能的稳定主要归功于线粒体融合及分裂相互平衡，即线粒体动力学(mitochondrialdynamics)平衡在前期的研究中，我们发现，益气温阳中药对心力衰竭大鼠心肌组织与健康乳鼠心肌细胞、成纤维细胞中PI3K-AKT-GSK3β、IP3-Ca11.1体重20020g健康成年Wistar雄性大鼠(济南朋悦实验动物繁育有限公司)75只，体重(200±20)g,合格证号：scxk(鲁)20140007。在山东省实验动物中心的动物房中清洁喂养。本实验遵循山东省实验动物中心实验动物使用管理规定，并通过山东中医药大学附属医院伦理委员会批准。1.2免部分颗粒饮料盐酸曲美他嗪片(20mg/片，批号H20055465,施维雅天津制药有限公司);黄芪免煎颗粒(每袋装2g,折算10g饮片，批号17006582,北京康仁堂药业有限公司);葶苈子免煎颗粒(每袋装0.5g,折算10g饮片，批号17005075,江阴天江药业有限公司)。均购买于山东中医药大学附属医院。1.3防视力收缩症状蛋白线粒体融合蛋白1(mitofusin1,Mfn1)antibody(英国abcam,货号：ab104274);线粒体融合蛋白2(mitofusin2,Mfn1)antibody(英国abcam,货号：ab57602);线粒体分裂蛋白1(fissionprotein1,Fis1)antibody(英国abcam,货号：ab71498);视神经萎缩症蛋白1(opticatrophy1,OPA1)antibody(美国CST,货号：80471);动力相关蛋白1(dynamin-relatedprotein1,Drp1)antibody(美国CST,货号：8570);盐酸阿霉素(100mg/瓶，中国Solarbio,货号：D107159)。HyPureTMMolecularBiologyGradeWater,HyClone;RNA提取液，Servicebio;三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司);β-actin,Servicebio,GB12001;FastStartUniversalSYBRGreenMaster(Rox),Roche;GAPDH,Servicebio,GB12002;RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit,Thermo。1.4超净工作台、超微量分光光度计透射电子显微镜(日本日立H-500IV);酶标仪(Bio-Rad,ELX500);台式高速冷冻型微量离心机(DragonLab,D3024R);荧光定量PCR仪(ABI,Steponeplus);匀浆仪(赛维尔生物，KZ-II);超净工作台(苏净安泰，SW-CJ-1FD);超微量分光光度计(Thermo,NanoDrop2000);离心管、TIP头(AxygenBiosciences;电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司，PL-203];酶标检测仪，Rayto,Rt2100c);冷冻离心机(healforce,neofuge13R);纯水仪(重庆艾科浦，AJC-0501-P);PaperTrimmer(Deli,NO.8014);双垂直电泳仪(北京六一仪器厂，DYCZ-24DN);转印电泳仪(北京六一仪器厂，DYCZ-40D);扫描仪(EPSON,V300);灰度分析软件(AlphaInnotech,alphaEaseFC);图像分析软件(Adobe,AdobePhotoShop)。22.1模型组和给药组将健康成年Wistar雄性大鼠75只，随机分为空白对照组、模型组、曲美他嗪组、黄芪葶苈子高剂量组、黄芪葶苈子低剂量组，每组15只。饲养于恒温、恒湿清洁级饲养室内，标准饲料(济南朋悦实验动物繁育有限公司提供)和酸化水自由饮食。模型组和各给药组第1天腹膜内注射浓度1mg/mL阿霉素溶液(3mg/kg),空白对照组注射等体积的生理盐水，2次/周，共6周。造模开始4周后，对模型组与空白对照组大鼠行超声心动图检查，锁骨下静脉取血检测BNP,进行统计学评价，评价造模结果。干预方法：(1)对照组、模型组：生理盐水4.0/ml·kg2.2指标和方法的检测2.2.1半推动状态下心肌组织块的制备大鼠在麻醉状态下迅速取出心脏，切下所需左室心肌组织，快速将所取心肌组织浸在含有固定液液滴的洁净蜡板上修切，快速(<2min)置入4%戊二醛固定液中并密闭。固定2h后，用磷酸缓冲液浸洗，选择梯度乙醇进行脱水。将纯丙酮和包埋剂按照1∶1的比例进行配制，对心肌组织块进行浸透90min。把浸透后的组织块包埋置入装满包埋液的模具上，放入温度60℃的烤箱内加热24～36h,聚合硬化成包埋块，用切片机切成0.5～2μm的半超薄切片，采用美兰染色后，光学显微镜下观察定位。通过超薄切片机切成厚度50～80nm的超薄切片。采用饱和醋酸铀和枸橼酸铅分步染色，在透射电镜下观察超薄切片。2.2.2rna浓度和纯度采用RT-PCR法进行检测，将心肌组织制成匀浆，使用Nanodrop2000检测RNA浓度及纯度。设计Mfn1、Mfn2、OPA1、Fis1、Drp1的引物，由武汉塞维尔生物科技有限公司合成，引物序列见表1。2.2.3凝胶电泳测定pvdf膜蛋白表达(1)进行蛋白质抽提，标本根据实验所需调整RIPA裂解液用量，10min低温离心12000r/min,弃上清液，并定量蛋白质，酶标仪读数(波长570nm)处并测算。(2)蛋白凝胶电泳。以实验仪器说明书基础步骤组装凝胶电泳装置，选取5%浓缩胶，9%分离胶，15%灌胶，配置灌胶完成30min后即可上样。上样体积20μl,含40μg蛋白。并注入电泳液、蛋白Marker,恒压电泳150min。(3)电泳结束以80V电压90min转至PVDF膜。(4)转膜后进行封闭60min,并加入一抗4℃孵育一晚、TBST清洗4次，再加入二抗孵育45min。(5)孵育二抗并清洗后的PVDF膜经TBST摇床后，与ECL发光液反应。(6)将胶片进行扫描，用凝胶图象处理系统分析目标条带灰度值。计算比较目的蛋白条带与内参的β-actin条带的累积光密度，作为相对表达量。2.2.4统计分析实验数据采用SPSS22.0软件进行统计学分析。所有计量资料采用33.1模型评估的结果造模4周后模型组大鼠超声心动图，左室舒张末内径(3.2在透射电镜下，各组大鼠心肌骨骼超微结构放大幅度为1500:空白对照组大鼠心肌线粒体规则排列，体积匀称，无肿胀变形，嵴清晰完整，肌节排列整齐，各部分结构完整；3.3在心力衰竭大鼠的心肌组织中与空白对照组比较，模型组与空白对照组比较，模型组3.4在心力衰竭大鼠的心肌组织中与空白对照组比较，模型组与空白对照组比较，模型组4复心汤对小鼠脏器正常治疗的作用作为一种高度动态变化的细胞器，线粒体通过自身的融合-分裂维持线粒体网络的稳态，而线粒体这种不断的融合和分裂的动态过程构成了线粒体动力学心肌细胞线粒体动力学的失衡可以造成心肌细胞能量代谢的障碍。线粒体融合和分裂足够活跃才能保证本实验在线粒体结构上，通过电镜切片观察到心力衰竭时心肌细胞的线粒体结构发生明显变化，包括体积增大，形状改变，排列紊乱，嵴断裂，肌节缺失等，黄芪葶苈子能够改善线粒体结构的变化，减轻线粒体的损伤。在线粒体调节蛋白上，空白对照组线粒体融合蛋白课题组在前期研究的基础上，进行拆方研究，选用复心汤组方中的主药黄芪葶苈子，其中黄芪重用为君药，为补益心气之主药，味甘性微温，《本草纲目》称其可“能补虚、益元气”,《名医别录》载其可“逐五脏间恶血”;葶苈子味苦微