阿司匹林对sd大鼠小肠组织ss、egfr、pge2及黏液影响的研究

阿司匹林对sd大鼠小肠组织ss、egfr、pge2及黏液影响的研究

近年来，随着我国医疗卫生的发展，人均期望寿命显著延长，人口构成的老龄化、高血压、冠状动脉粥样硬化和风湿性疾病的患者数量日益增加。冠状动脉粥样硬化（如阿司匹林）常被用作临床应用。这种药物不仅有治疗作用，而且还有一些副作用。长期以来，人们更加重视由胃肠和十二指肠引起的损害，但通过肠镜的普及，发现nsag的肠副作用非常低。最近研究表明服用NSAIDs的患者中有50%出现小肠黏膜破坏1材料和方法1.1实验分组、分组实验动物为成年健康SD大鼠(重庆医科大动物实验室)32只,雌雄各半,体重(198.59±18.83)g,各组间在性别、年龄、体重上无显著差别,饲养标准棒状饲料,自由饮水,室温(23±2)℃,12h昼夜交替光照,实验前适应性喂养1周。随机分为四组,Ⅰ组(灌胃组)8只,精氨酸阿司匹林注射液灌胃;Ⅱ组(灌肠组)8只,精氨酸阿司匹林注射液灌肠;Ⅲ组(腹腔注射组)8只,腹腔注射精氨酸阿司匹林注射液;以上三组精氨酸阿司匹林注射液(海南灵康制药有限公司,产品批号100601)用量为100mg/kg,每天2次;Ⅳ组8只不采取任何干预措施,自由饮水,饮食,饲养2周后断颈处死实验动物后留取距回盲瓣5cm的回肠组织保存于-80℃备用。1.2对肠粘膜损伤的评估采用Chiu氏6级评分法1.3阿利辛蓝染色试剂配制:3%醋酸溶液:冰醋酸3ml+蒸馏水97ml。阿利辛蓝溶液(pH2.5):阿利辛蓝1g+3%醋酸100ml。0.1%核固红溶液:核固红0.1g+硫酸铝5g+蒸馏水100ml,硫酸铝溶于水中,加核固红,慢慢加热到沸腾并把它冷却过滤,并添加一粒百里香酚作为防腐剂。取石蜡包埋的各组动物末段回肠组织,切片、脱蜡至水,阿利辛蓝着色30min,自来水冲洗。0.1%核固红溶液复染核5min,自来水冲洗,脱水,封片,显微镜观察。采用ImageProplus图像分析软件进行半定量分析,每个样本随机检测5个染色较好的高倍视野(×400),计算黏液的阳性面积及积分光密度(IOD),得出5个高倍视野的均数,即代表该样本黏膜表面及杯状细胞中的黏液IOD值。1.4离心液、离心液、无定形液制备取上述回肠组织100mg,剪碎为3mm×3mm大小,加入1mlPBS液,低温匀浆,放入1.5ml离心管,离心1000r/min,4℃,5min,取上清液分装待用。按试剂盒(活乐生物有限公司,上海)说明书操作。1.5免疫组织化学检测检测细胞因子取石蜡包埋的各组动物末段回肠组织切片,脱水后行免疫组化染色。免疫组化一抗分别为:1∶200兔抗鼠SST单克隆抗体,兔抗鼠EGFR单克隆抗体,兔抗鼠PGE2单克隆抗体;二抗试剂盒,SP免疫组化检测试剂盒及DAB显示液,以上试剂均来自博奥森公司(北京,中国)。切片经脱蜡至水,修复抗原、一抗、二抗程序作用后,加入酶标链霉卵白素复合物,DAB室温显色,苏木素复染,脱水,封片,显微镜观察。以细胞质及细胞膜染为棕黄色为阳性细胞。采用ImageProplus图像分析软件进行半定量分析,每个样本随机检测5个染色较好的高倍视野(×400),计算阳性细胞IOD值,得出5个高倍视野的均数,即代表该样本阳性细胞IOD值。1.6统计方法用SPSS20统计软件进行四组间秩和检验及Dunnettt检验,差异显著性水平设定为P<0.05。2结果3不同给药途径对小鼠肠黏膜流变学及病理生理的影响NSAIDs相关性肠病中典型的病理改变为小肠黏膜炎症、糜烂、溃疡、黏膜下层纤维增生,引起肠腔狭窄等人类胃、小肠黏膜含有丰富的PGE2,它是小肠黏膜重要的保护因素。PGE2具有广泛的生物活性,在抑制胃酸分泌,保护黏膜细胞等方面有着重要的作用。PGE2具有直接的血管扩张作用,增加肠道黏膜的血流量;在组织炎症时,通过抑制炎症细胞的黏附、抑制炎性细胞因子介导的细胞损伤等途径,发挥其对黏膜细胞的保护作用。NSAIDs对胃、肠黏膜中PGE2的影响是早已明确的。NSAIDs可以通过以下几方面引起小肠的损害小肠上皮主要由吸收细胞、杯状细胞和少量的内分泌细胞构成。杯状细胞散在吸收细胞之间,其主要功能是分泌黏液,在吸收细胞表面形成一层黏液层。小肠黏膜的完整性和其表面的黏液层是小肠重要的物理、生物和化学屏障,避免肠腔内有害物质的侵入。而黏液量的多少与阿利辛蓝染色的IOD值和厚度成正相关。灌胃组、灌肠组、腹腔注射组阿利辛蓝染色面积及IOD值比正常组都低。提示阿司匹林注射液通过某种方式降低了小肠杯状细胞合成和分泌黏液的能力。而三组不同给药方式中,腹腔注射组的黏液量又最少,黏液分泌受抑制的程度与各组PGE2的变化无平行关系。说明PGE2只是影响黏液分泌的重要因素之一。SST是1973年首先从下丘脑分离出来的一个具有14个氨基酸的肽类激素,SST细胞在神经系统、消化系统都有大量分布。本文结果显示灌胃组、灌肠组及腹腔注射组小肠组织中SST的浓度、IOD值无明显变化。由于调节SST合成和分泌的因素较多,SST水平的无差异,提示我们影响SST合成和分泌的因素可能没有受到影响,或是各种变化的因素之间相互抵消了引起的SST变化。其功能很多,除了可抑制胃肠分泌和胰腺的内外分泌外,有免疫调节、肠道细胞保护等多种作用SST与PGE2之间的相互作用也很复杂。SST可以通过抑制PGE2引起的肠黏膜分泌减少,抑制小肠黏膜碳酸氢盐的分泌降低肠黏膜细胞的自身保护机制。而PGE2则可能增加小肠黏膜黏液的分泌量,增加黏膜中SST的含量EGFR属于跨膜受体酪蛋白氨酸蛋白激酶家族,可介导细胞的代谢、增殖、分化、黏附、迁移等生命现象。有研究表明在胃黏膜损伤修复中有EGFR的高度表达,对胃黏膜的保护及其损伤的修复有很重要的作用总之,阿司匹林在不同给药途径下,2周均可引起大鼠小肠黏膜的损伤。这种损伤中,小肠黏膜的完整性破坏和黏膜黏液的分泌受到了明显影响,而腹腔注射给药对小肠黏膜黏液的合成和分泌影响最大。可能这些改变与PGE2的降低有关。无明确结果表明SST和EGFR参与了NSAIDs性肠病的病理生理过程,但不排除SST受体的变化影响了SST的作用。2.1肉眼观察回肠标本,未发现明显水肿、糜烂、溃疡、出血、坏死、梗阻、穿孔等现象,见图1。2.2对回肠黏膜损伤进行评分正常对照组肠黏膜损伤评分最小为0(P<0.05),Ⅰ组(灌胃组)为3.00±0.76,Ⅱ组(灌肠组)为2.75±0.71,Ⅲ组(腹腔注射组)为2.88±0.64,三组阿司匹林肠黏膜损伤评分两两比较无差别。见表1。2.3阿利辛蓝染色显示肠黏膜黏液分布及量变杯状细胞位于黏膜层,散在于吸收细胞间,分泌黏液,杯状细胞中的黏液及黏膜表面黏液与阿利辛蓝结合后呈蓝色(图2)。在光镜下正常对照组肠壁结构清晰,黏膜上皮完整,绒毛排列紧密,杯状细胞较多。三组阿司匹林组的肠壁结构清晰,黏膜厚度变薄,黏膜上皮有脱落现象,绒毛萎缩变短,间隙增大,排列不整齐,黏膜腺体排列稀疏,杯状细胞减少。测量杯状细胞黏液的面积和IOD值均比正常对照组低(表1,P<0.05)。三组不同给药方式中,腹腔注射的面积及IOD值最低(P<0.05)。2.4ELISA定量分析大鼠回肠SST、EGFR、PGE2灌胃组、灌肠组及腹腔注射组SST、EGFR水平与正常对照组无差异;灌胃组、灌肠、腹腔注射组的PGE2均数比正常