兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座

第一节普通毒性试验一、急性毒性试验(1)经口或注射给药急性毒性试验(2)经皮给药急性毒性试验目标：（1）求出受试物半数致死量（LD50）。（2）说明受试物急性毒性剂量-反应关系与中毒特征，为抢救治疗办法提供依据。（3）为受试物毒性作出初步判断，为其它毒性试验设计提供依据。1兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第1页经口或注射给药急性毒性试验1.动物小鼠（体重18～22g）、大鼠（体重180～200g）或其它敏感动物。应注明动物品系。每组小鼠不少于10只、大鼠不少于6只，雌雄各半，雌性应未产无孕。2.供试药品配制普通用水为溶剂,将药品配成一定浓度溶液.2兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第2页

3.给药方式与最大致积

灌胃法:一次最大灌胃量1.0ml/只(小鼠)4.0ml/只(大鼠)

腹腔注射:一次最大注射量1.0ml/只(小鼠)3.0ml/只(大鼠)4.剂量与分组预试验全部致死最小剂量LD100和全部存活最大剂量LD0正式试验5-7个剂量组,组间剂量呈等比级数,其比值为1.2-1.4.3兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第3页

5.观察指标

动物普通健康情况，中毒表现和死亡过程。时间：7天。死亡动物：大致剖检、病理组织学检验（必要时）6.LD50计算

寇氏法计算供试药LD50值及其95%可信限范围。7.结果判定

大鼠一次经口LD50在1mg/kg以下为极毒，1～50mg/kg为剧毒，50～500mg/kg为中等毒，500～5000mg/kg为低毒，5000

mg/kg以上者为实际无毒。4兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第4页小鼠腹腔注射敌百虫LD50计算表

组别剂量(mg/kg)对数剂量(Xi)试验动物数(ni)死亡动物数(ri)死亡率(pi)存活率(q)13002.47711000123602.55631020.20.834322.63551050.50.545182.71431070.70.356222.793810101.00累计---∑

ri24∑

Pi2.4∑q2.65兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第5页

计算LD50，代入以下公式：

lgLD50=Xk-d（∑Pi–0.5)LD50=Lg–1[Xk-d（∑Pi–0.5)]式中Xk

为最大对数剂量,∑Pi为死亡率总和;d为相邻两组剂量比值对数,d=lg1.2=0.0792则:LD50=Lg–1[2.7938-0.0792(2.4-0.5)]=Lg–12.6433=439.87(mg/kg)6兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第6页经皮给药急性毒性试验1.动物

选取健康家兔（2.0～3.0kg）、豚鼠(350～450g)或大鼠(200～300g)，每组动物不少于6只，雌雄各半。2.供试药品配制供试药品如是固体，应磨成细粉状，过120目筛，并用适量水或无毒无刺激性赋型剂（橄榄油、羊毛脂、凡士林等）混匀。如为液体，普通不要稀释。7兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第7页

3.给药方式

脱去动物背部脊柱两侧毛发（不得损伤皮肤），脱毛后二十四小时检验皮肤，如无损伤才能进行试验。将供试药物均匀地涂敷于脱毛区，不应少于动物体表面积10%，用塑料纸和两层纱布覆盖，再用胶布或绷带固定，以防脱落和动物舔食。敷药二十四小时。试验结束后，用温水或适当溶剂去除残留供试药。大鼠可采取浸尾方法给药。8兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第8页

4.剂量与分组

正式试验前，用少许动物做预备试验，依据24小时内动物死亡情况，预计LD50可能范围，以确定正式试验剂量。普通分为4个剂量组，组间剂量呈等比级数。其比值为：1:1.5-3.0。若用赋形剂，需设赋形剂对照组。9兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第9页5.观察指标

观察动物全身中毒表现和死亡情况，观察时间为一周。若给药4天后仍有动物死亡时，仍需继续观察一周，对死亡动物应做大致剖检，必要时进行病理组织学检验。10兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第10页

6.结果判定

兔涂皮LD50在5mg/kg以下为极毒，5～44mg/kg为剧毒，44～350mg/kg为中等毒，350～2180mg/kg为低毒，2180mg/kg以上者为实际无毒。11兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第11页二、亚慢性毒性试验确定外来化学物质在动物1/10左右生命时间内，重复屡次接触后有没有引发损害观察过程。又称短期试验、亚急性毒性试验（Subchronictoxicitytest）。

目标：1.毒性确定2.靶器官3.慢性毒性试验依据12兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第12页试验方法1.动物

普通选取大鼠(100～200g)或小鼠(15～20g)。有条件时，采取供试药品靶动物鸡等。外购动物需喂养一周后才能供试验用。13兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第13页2.试验周期

临床用药期（天）毒性试验给药期（天）1～314728309030天以上6个月14兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第14页3.给药方式

试验周期给药路径14天大鼠、小鼠灌胃

鸡

药丸28天以上混饲自由采食饮水不限15兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第15页4.剂量与分组

大鼠20只/组，雌雄各半对照组低剂量组高于有效量，不出现毒性反应中剂量组高剂量组部分动物出现毒性反应或死亡但死亡数不超出20%16兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第16页5.观察指标

分六大项，详细指标为：（1）健康情况天天（2）体重，饲料消耗2-3次/周（3）血液学检验定时（4）血液生化学检验定时（5）肝、肾绝对重量和脏器指数试验结束时（6）剖检、组织病理学检验试验结束时17兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第17页6.结果处理

试验数据方差分析或X2

病理改变照片写出评价汇报18兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第18页三、长久毒性试验1.概念外来化学物质在动物生命期大部分时间或终生接触于机体时所引发损害作用，称为长久毒性作用或慢性毒性作用。确定外来化学物质这种慢性毒性作用动物试验观察方法，称为长久毒性试验。19兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第19页2.目标观察长久重复摄入低剂量受试物，可能对机体造成损害、严重程度、停药后发展和恢复情况，为临床试验提供依据。3.试验方法（1）动物

两种动物（啮齿类和非啮齿类），当前要求用一个啮齿类动物进行全方面系统试验。20兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第20页

（2）剂量分组

试验组：4～5个，设高剂量组1～2个，中剂量组1～2个，低剂量组1～2个。

以LD501/10、1/50、1/100、1/1000剂量分组。对照组：1个（3）染毒方式混饲或饮水，由动物自由进食。或涂擦皮肤。21兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第21页（4）观察指标普通情况：健康、生长发育、进食量，尤其是体重。生物化学指标：肝、肾功效。血液学改变：Hb，WBC，RBC，病理学检验：病了解剖和病理组织学改变。（5）结果评价参考亚急性毒性试验。22兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第22页第二节特殊毒性试验致突变:

体外:（1）艾母氏(Ames)试验(必做)（2）哺乳动物培养细胞染色体畸变（CHO、CHL）选做体内:（3）微核试验(必做)（4）精子畸形试验选做（5）小鼠睾丸精原细胞染色体畸变试验选做（6）显性致死试验若（4）、（5）任一项为阳性，必做（6）23兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第23页

致畸:（1）传统致畸试验(必做)普通兽药必做（2）喂养繁殖毒性试验（3）喂养致畸试验（2）、（3）饲料药品添加剂必须增做24兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第24页一、艾母氏(Ames)试验方法1.原理组氨酸缺点型（即突变型）鼠伤寒沙门氏菌在缺乏组氨酸培养基上不能生长，但在加有致突变原培养基上培养，则可使突变型产生回复突变成为野生型，即恢复合成组氨酸能力，于是就能在缺乏组氨酸培养基上生长，依据其生长菌落数量判断受试物是否含有致突变性。25兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第25页

野生型（能合成组氨酸）

缺乏组氨酸培养基加有致突变原培养基组氨酸缺点型（即突变型）鼠伤寒沙门氏菌。。。。。。

。26兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第26页

2.菌种组氨酸营养缺点型鼠伤寒沙门氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102四个标准株。3.剂量分组每次试验要求4--5个剂量组，每个剂量做三个平行平皿。高剂量以不抑菌为标准。液态受试物：0.05-50ul/平皿固态受试物：0.1-1000ug/平皿，最高剂量可达5000ug/平皿。

选定后剂量药品应配制成适当浓度体积：100ul或200ul/皿。27兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第27页

4.溶剂水5.对照物每次检测均需要阳性对照：已知阳性药品阴性对照：溶剂

加S9混合液时要同时作不加S9混合液对照平皿6.S9混合液假如受试物可能是经动物体酶系统活化代谢后才含有致突变作用，则试验过程需要在培养基上同时加入哺乳动物肝微粒体（S9混合液），使受试物被活化而展现致突变作用。

28兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第28页

S9制备

选体重200g左右成年雄性大鼠，经诱导剂诱导后宰杀（处死前12小时禁食）。在低温条件下，无菌操作取出肝脏，用KCI液淋洗后置匀浆器中制成匀浆。低温离心后分装，保留于液氮或–80℃冰箱。29兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第29页

7.试验步骤

TA97aTA98TA100TA10237℃水浴振荡培养活菌数不得少于1～2x109/ml

增菌培养液增菌培养液增菌培养液增菌培养液30兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第30页试验步骤

受检物+菌液+S9混合液或磷酸盐缓（0.1-0.2ml）（0.1ml）（0.5ml）

37℃水浴振荡培养20imns加入45℃顶层培养基2ml混匀37℃培养48h

无菌小试管含底层培养基平皿31兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第31页8.结果评价

受试组菌落数大于2倍自发回变数，并有剂量反应关系和重现性，判为诱变阳性。32兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第32页二、微核试验

原理：骨髓细胞染色体经诱变物作用，发生突变后出现断裂，并有部分断片在有丝分裂后期不移向两极，在有丝分裂末期不进入分裂细胞核中，因而存留于细胞浆中，形成一个或几个圆形至杏仁状结构，并存留一定时间。因为这种圆形结构比普通细胞核小，故称微核（micronucleus）。33兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第33页图示原理：

诱变物嗜多染红细胞微核直径相当于红细胞直径1/20～1/5。34兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第34页

1.动物

成年健康小鼠（品系），随机分为受试组和对照组。10只/组，雌雄各半。2.受试物处理将受试物溶于适宜溶剂中,以0.1-0.2ml/10g体重给药体积配制成适当浓度。3.给药方式给药路径：与临床用药路径相同。内服时需灌胃。给药剂量：以LD50为依据，设三个剂量组。高剂量组LD500.8-0.5；低剂量组LD500.05-0.1

并设阴性对照和阳性对照组，阳性对照物可选取已知能诱发微核阳性诱变剂。35兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第35页

4.试验操作

一次给药：24，48，72小时取样制片。

二次给药：第二次给药后6，二十四小时取样制片。处死小鼠，将股骨骨髓洗入离心管，离心，常规涂片。姬姆萨染色，镜检。5.镜检计数：1000个嗜多染红细胞（PCE）/片求出：嗜多染红细胞/正染红细胞（NCE）必要时，丫啶橙染色，荧光显微镜分析计数。36兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第36页

6.结果评价

将数据列表，分别列出嗜多染红细胞数，微核数及PCE/NCE之比。所得结果用t检验进行数据分析，经重复试验P<0.01并有剂量反应关系时，判为阳性。37兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第37页三、异常毒性检验

（一）目标

将一定剂量供试品溶液注入小鼠体内或口服给药，在要求时间内观察小鼠死亡情况，以判定供试品是否符合要求一种方法。

38兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第38页

（二）试验动物

小鼠健康无伤，体重17～20g。做过本试验小鼠不能重复使用。39兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第39页（三）检验方法

取5只小鼠，按药品给药路径，每只小鼠分别给予供试品溶液0.5ml。静脉注射：尾静脉注入供试品溶液，注射时间普通为4～5秒，要求迟缓注射药品可延长至30秒。皮下注射：可见注射部位皮下出现泡状隆起。40兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第40页（四）结果判定

除另有要求外，5只小鼠在给药后48小时内不得死亡。如有死亡，另取体重17～20g小鼠10只复测，全部小鼠在48小时内不得有死亡，不然，判为不合格。41兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第41页第三节制剂安全性评价一、热原反应试验二、溶血性检验三、局部刺激性试验1.家兔点眼法2.家兔股四头肌法四、过敏性试验五、降压物质检验42兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第42页一、热原反应试验1.概念是指一些微生物尸体及其增殖时产物,主要是细菌一个内毒素。大多数细菌都能在增殖时产生热原，霉菌与酵母菌也能产生热原。热原随注射液进入动物体后，轻则能引发体温升高，严重虚脱死亡。43兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第43页

检验对象：注射用原料溶媒注射液注射器44兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第44页注射剂热原污染路径1.溶媒注射用水2.原料适宜微生物生长、生物制品

如葡萄糖、水解蛋白、氯化钠

3.用具或容器污染4.生产过程中污染及时灭菌，缩短时间45兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第45页热原性质1.耐热性

60℃1小时不受影响;180-200℃干热2小时或250℃30mins彻底破坏2.滤过性过细菌滤器;不能过透析膜3.水溶性

不溶于有机溶媒4.不挥发性但可随水蒸气带入蒸馏水5.被吸附性

活性炭,硅藻土,树脂等46兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第46页除去热原方法1.预防污染

药液、溶媒（二十四小时内ddH2O）2.去除热原

容器用强酸、强碱、干热3.吸附

0.1-0.2%活性炭；多层石棉板4.超声波破坏热原5.氧化剂

高锰酸钾、双氧水47兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第47页2.热原检验法本法系将一定剂量供试品，静脉注射入家兔体内，在要求时间内，观察家兔体温升高情况，以判定供试品中所含热原程度是否符合要求。48兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第48页(1)选符合要求家兔1.健康无伤，体重1.7～3.0kg，同一起源、同一品系，雌兔无孕。2.1兔1笼，标兔号，经7日同一喂养条件喂养，测温条件相同。在此期间，体重应不减轻，精神、食欲、排泄等不得有异常。49兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第49页(2)试验前准备1、试验前1～2日，供试用家兔应处于同一温度环境中，试验室与喂养室环境温度相差不得大于5℃。50兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第50页2.室温应在17～28℃，在试验全部过程中，应注意室温改变不得大于3℃，应防止噪音干扰。3.家兔在试验前停食1小时并置于固定盒内，直至试验完成。51兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第51页4、肛温计插入深度约6cm，不得少于1.5分钟，每隔30分钟测量体温1次，普通测量2次，两次体温之差不得超出0.2℃，以此两次体温平均值作为该兔正常体温。52兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第52页

5.试验用注射器、针头及一切与供试品溶液接触器皿，应置烘箱中用250℃加热30分钟或用180℃加热2小时，也可用其它适宜方法除去热原。53兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第53页(3)检验方法1.每个供试样品用家兔3只，在测定正常体温(38.3-39.6℃)后15分钟内给药。2.供试品注射体积，按家兔体重不少于1ml/kg，小于10ml/kg，体积在5～10ml/kg溶液应在37～38℃预热后注射。54兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第54页3.耳静脉迟缓注射，但每兔不超出3分钟。4.给药后每隔30分钟测温1次，共测6次。55兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第55页5、温差计算：（1）以6次体温中最高一次减去正常体温，即为该兔体温升高温度。（2）以6次体温中最低一次减去正常体温，即为该兔体温降低温度。56兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第56页(4)结果判断1.判断复试：（1）初试3只兔中仅有1只体温升高0.6℃或0.6℃以上，或3只家兔升温均低于0.6℃，但升温总数达1.4℃或1.4℃以上,应另取5只家兔复试。57兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第57页（2）含有热原供试品，普通在给家兔静脉注射后1~2小时出现升温高峰，当第3小时升温大于0.6℃时，宜复试后再作判断。（3）3只家兔中有1只降温值小于0.6℃，或3只家兔中有2只降温值在0.45~0.55℃，应另取3只家兔复试。58兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第58页2.判断合格（1）初试3只家兔中，体温升高0.6℃以下，而且3只家兔升温总数在1.4℃以下可判断为符合要求。59兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第59页（2）复试5只家兔中，体温升高0.6℃或0.6℃以上家兔数仅有1只，而且初复试合并，8只家兔升温总数为3.5℃或3.5℃以下，可判断为符合要求。

60兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第60页3、判断不合格（1）初试3只家兔中，体温升高0.6℃或0.6℃以上家兔数有2只或3只，可判断为不符合要求。61兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第61页（2）复试5只家兔中，体温升高0.6℃或0.6℃以上家兔数有2只或2只以上，可判断为不符合要求。（3）初复试合并8只家兔升温总数超出3.5℃，可判断为不符合要求。62兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第62页

二、中草药注射剂质量检验1.急性毒性

中草药注射剂耐受量应为家畜临床用量100倍为安全，60倍以上者可慎用。63兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第63页详细方法取小鼠5只，尾静脉或腹腔注射0.5ml药液，观察小鼠有没有震颤、惊厥、四肢瘫痪、步态不稳、竖毛、呼吸抑制或死亡等反应。普通观察48-72小时，如有死亡，应另取10只重做，不得有死亡。64兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第64页2、溶血试验含皂苷或鞣质或成份还未十分明确中草药注射液必须做溶血试验。65兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第65页详细方法（1）2%兔红细胞生理盐水配制

兔耳缘静脉采血1ml，置青霉素小瓶（西林瓶）中，加玻璃珠搅拌除纤维蛋白，用生理盐水离心洗涤至上清液澄清为止，然后配成2%混悬液。

66兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第66页（2）溶血试验设计表试管号1234567被试药液（ml）0.10.20.30.40.500生理盐水（ml）2.42.32.22.12.02.50红细胞液（ml）2.52.52.52.52.52.52.5蒸馏水（ml）0000002.567兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第67页

取洁净试管7支，按上表排列加入各种溶液，第6管为阴性对照管，第7管为阳性对照管。各管轻轻摇匀后，37℃恒温箱或水浴中保温（或25-37℃室温下），开始每隔15分钟，1小时后每隔1小时分别观察1次，共3小时。68兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第68页（3）结果判断判定标准:1.全溶血:溶液澄明红色,管底无红细胞残留.2.部分溶血:溶液澄明红色或棕色,管底有少许红细胞残留.3.无溶血:红细胞全部下沉,上层液体无色澄明.4.凝集:虽不溶血,但出现红絮状物,振摇后不能分散.将凝集物置于载玻片上,盖上盖玻片,从边缘滴加生理盐水,显微镜下观察,红细胞散开者为假凝集,反之为真凝集.69兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第69页

结果判定:普通认为,第3管或第3管以前被试药液在30分钟内引起溶血、部分溶血或出现凝集现象，不宜作静脉注射用；不溶血或出现假凝集现象才可作注射用。70兽药的毒理学试验和安全性评价专家讲座第70页