基因诊疗医学知识讲座

基因诊疗医学知识讲座基因诊疗医学知识讲座第1页第一节 基因诊疗概念 及常见技术基因诊疗医学知识讲座第2页基因诊疗—利用分子生物学技术，从 DNA/RNA水平检测基因存在,分析基因结构变异和表示状态，从而对疾病作出诊疗。一、基础概念基因诊疗医学知识讲座第3页二、基因诊疗常见方法㈠ 核酸分子杂交㈡ PCR㈢ DNA序列测定㈣ DNA芯片技术基因诊疗医学知识讲座第4页(一) 核酸杂交基础原理-------核酸变性和复性理论

即双链核酸分子在一些理化原因作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双链结构。所以应用已知碱基序列单链核苷酸片段作为探针，就可检测样本中是否存在与其互补同源核苷酸序列。基因诊疗医学知识讲座第5页probeprobe基因诊疗医学知识讲座第6页核酸杂交关键要素probeDNAtargetDNAsignaldetection基因诊疗医学知识讲座第7页核酸杂交方法分类按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交两种类型。固相杂交是将参加反应一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸游离在溶液中。液相杂交所参加反应两条核酸链都游离在溶液中。基因诊疗医学知识讲座第8页固相杂交分类Southern印记杂交Northern印记杂交斑点杂交原位杂交基因诊疗医学知识讲座第9页Southernblot是最经典基因分析方法，不但能检出特异DNA片段，而且能进行定量和测定分子量，可用于基因酶切图谱分析、基因突变分析等。基因诊疗医学知识讲座第10页Northern杂交用于RNA检测，能对组织细胞中总RNA或mRNA进行定性和定量分析。基因诊疗医学知识讲座第11页斑点杂交（Dotblot）

可用基因组中特定基因及其表示定性及定量分析，方法简单、快速灵敏、样品用量少；其缺点是不能判定所测基因分子量，特异性不高，有一定百分比假阳性。基因诊疗医学知识讲座第12页原位杂交

（Colonyinsituhybridization）

可查明染色体中特定基因位置，用于染色体疾病诊疗；原位杂交结果是显示相关核酸序列空间位置情况，所以可检出含核酸序列详细细胞，细胞详细定位，数目和类型，可检出基因和基因产物亚细胞定位。基因诊疗医学知识讲座第13页（二）利用PCR及结合其它技术进行基因诊疗直接采取PCR进行基因诊疗采取PCR产物限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLPs）进行基因诊疗采取PCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针（ASO）斑点杂交进行基因诊疗*经过PCR产物反相点杂交(RBD)进行基因诊疗采取PCR产物单链构象多态性(SSCP)分析进行基因诊疗采取PCR技术对靶核酸进行定量分析基因诊疗医学知识讲座第14页寡核苷酸杂交分析SNP和等位基因特异寡核苷酸杂交（ASO）#基因诊疗医学知识讲座第15页（三）DNA序列测定

DNA序列测定是进行基因突变检测最直接、最准确方法，能够确定突变部位，突变性质。基因诊疗医学知识讲座第16页（四）DNA芯片技术

应用DNA芯片，能够检测基因结构及其突变多态性，对基因表示情况进行分析。基因诊疗医学知识讲座第17页二基因诊疗特点高特异性高灵敏度取得稳定结果早期快速适用性强，应用范围广基因诊疗医学知识讲座第18页第二节遗传病基因诊疗基因诊疗医学知识讲座第19页一、概述人类遗传病达数千种地中海贫血在意大利等国家发病率达10％镰状细胞贫血在美国黑人中发病率达14％我国常见遗传性疾病有地中海贫血、异常血红蛋白病和血友病。有效治疗难；经过基因诊疗进行携带者筛查，产前早期诊疗，降低发病率。基因诊疗医学知识讲座第20页二、镰状细胞贫血血红蛋白病（异常血红蛋白病）红细胞呈镰刀状，寿命短，引发溶血性贫血。患者多在成年以前死亡基因诊疗医学知识讲座第21页×MstⅡ酶切位点(CCTNAGG)5´3´正常基因5´3´突变基因1.15kb1.35kb（一）镰状红细胞贫血分子机制5 6 7--Pro Glu Glu—--CCT

GAG

GAG--5 6 7--Pro Ala Glu—--CCT

GTG

GAG--基因诊疗医学知识讲座第22页（二）镰状细胞贫血基因诊疗方法限制性内切酶/Southernblot

采集制备血液DNA→内切酶MstⅡ消化→电泳→转膜→32P标识β珠蛋白cDNA杂交→放射自显影基因诊疗医学知识讲座第23页+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着患者镰状红细胞贫血患者基因组限制性酶切分析基因诊疗医学知识讲座第24页PCR/限制性内切酶设计引物→PCR扩增→产物进行限制性内切酶酶切→电泳→EB染色→直接观察例：引物1：5’-GGGCTGGGCATAAAAGTCA-3’引物2：5’-AATAGACCAATAGGCAGAG-3’

扩增产物294bp镰状细胞贫血基因诊疗方法基因诊疗医学知识讲座第25页引物1CCT

GAG

GAGCCT

GTG

GAG引物1引物2引物2294bp103bp191bpMstⅡ酶切位点(CCTNAGG)基因诊疗医学知识讲座第26页+﹣103bp191bp294bp正常人突变携带着患者镰状红细胞贫血患者PCR产物限制性酶切分析基因诊疗医学知识讲座第27页RT-PCR/序列分析

采集制备血液RNA→RT-PCR→产物测序→推测氨基酸序列→进行诊疗镰状细胞贫血基因诊疗方法基因诊疗医学知识讲座第28页二、β－地中海贫血

(β－Thalassaemia,简写βthal或βT)β珠蛋白基因突变造成该多肽链合成大为降低（β＋）或完全缺失（β0）β珠蛋白合成速率降低，造成β链和α链合成不平衡→多出珠蛋白链沉积在红细胞膜上→改变了膜通透性和硬度→造成溶血性贫血。高危人群地中海人、中东人、印度人、中国人；中国人群中又一广东、广西、四川、贵州等省发病率最高。缺乏有效治疗办法。基因诊疗医学知识讲座第29页（一）β地贫病分子基础β珠蛋白基因全长2053bp，含2个内含子（IVS－I和IVS-II），3个外显子。当前发觉突变有百余种，中国人群发觉约20种；普通对特定种族来说，90%β地贫基因仅由4～6种突变组成。基因诊疗医学知识讲座第30页（二）β地中海贫血基因诊疗PCR/ASO斑点杂交法 合成2对PCR引物（扩增区段700bp和580bp，分别包含14种和1种可能突变）→合成等位特异寡核苷酸(ASO)探针（4～6对，分别标识） →制备DNA样品 →PCR扩增 →斑点印迹杂交RFLP分析法基因诊疗医学知识讲座第31页三α地中海贫血基因诊疗ac左侧缺失4.2kb右侧缺失3.7kbbbbaα2α1α1α2N端α1C端正常基因序列PCR扩增法——定性分析左侧缺失型基因序列右侧缺失型基因序列ac扩增0.4kbab无扩增片段ab扩增1.2kb基因诊疗医学知识讲座第32页+﹣0.4kb1.2kb正常人右侧缺失患者地中海贫血患者基因组PCR分析左侧缺失患者基因诊疗医学知识讲座第33页四、杜氏肌营养不良症（DMD）

1.DMD是常见性连锁隐性遗传病，

2.主要特征是进行性肌萎缩和肠肌假性肥大，XP21.21—21.3区抗肌萎缩蛋白基因突变形式不一样。

DMD多在5岁发病，10岁左右瘫痪，在20岁左右因为心力和呼吸衰竭而死亡，其发病率为活产男婴1/3500。

基因诊疗医学知识讲座第34页（一）DMD分子基础：

抗肌萎缩蛋白基因长约2900kb，含79个外显子。抗肌萎缩蛋白基因突变分为基因缺失型和非基因缺失型。（1）DNA片段缺失（60%病例→造成阅读框移码→移码实变→致DMD，整码缺失→BMD）。缺失2个热点区①该基因5’端处②45~55外显子范围内。（2）非基因缺失型个别重复（病例5%）基因诊疗医学知识讲座第35页（1）基因组探针法 用XP21区分离得到不一样探针如（P20）来进行对应内切酶酶谱分析、检出率取决于探针数和酶切位点数目。（2）cDNA探针法 抗肌萎缩蛋白基因系列cDNA探针分析患者基因缺失、外显子拼接改变和基因内个别重复。（3）多重PCR法 如有些人设计多对引物进行多重PCR扩增该基因9个易发缺失“热点区”DNA片段，可检出80%有基因缺失DMD患者。（4）多态性分析法 基因内及其旁侧探针进行RFLP连锁分析。（5）RT—PCR扩增该基因外显子（全长2.4MB、外显子起来全长c14kb、用多对引物）可检出：外显子拼接异常。联用测序：可定位基因缺失起始和终止。基因诊疗医学知识讲座第36页1、苯丙酮尿症是一个常见隐性遗传性氨基酸代谢病。2、主要特征：（1）苯丙氨酸酪氨酸→多巴→儿茶酚胺苯丙酮酸酪胺黑色素

（2）患儿出生后须及早得到低phe饮食治疗，不然发生不可逆大脑损害和严重智力发育障碍。

苯丙氨酸羟化酶↓（肝）五、苯丙酮尿症（PKU）基因诊疗医学知识讲座第37页（一）PKU分子基础（1）迄今约3/4造成中国人PKU突变基因已被查清，它们分属11种PAH基因点突变。体外研究表明，这些突变造成PAH活力↓或丧失。（2）PAH第11外显子第399密码GTA（val）→GTT（val）中性突变：①不改变任何限制酶识别位点，故又称“序列多态性”。②这一“序列多态性”在PKU患者和正常人中存在着连锁不平衡性，故可作为一个“遗传标识”应用于产前诊疗。基因诊疗医学知识讲座第38页①PCR/ASO探针法和PCR-RFLP连锁分析法。②PCR/SSCP③直接测序法—若待诊疗PKU家系基因突变类型尚属“未知”或无RFLP信息。（二）PKUDNA诊疗基因诊疗医学知识讲座第39页先合成ASO如： 正常探针： TCCATTAACAGTAAGAATTT

突变探针： TCCATTAACAATAAGAATTT利用PCR/ASO探针法诊疗苯丙酮尿症基因诊疗医学知识讲座第40页利用PCR/ASO探针法诊疗苯丙酮尿症▽◎△▲ ○◎△健康男性 ▽男性携带者

▲男性患者○健康女性 ◎女性携带者 ●女性患者●▽正常探针突变探针基因诊疗医学知识讲座第41页第三节肿瘤基因诊疗基因诊疗医学知识讲座第42页1 经过检测肿瘤染色体易位及融合基因诊疗肿瘤 慢粒：（染色体易位）费城染色体

PCR检测融合基因

2 检测肿瘤相关基因癌基因（ras）、抑癌基因（

p53）、肿瘤转移基因3 检测肿瘤相关病毒基因

HBVHCV－肝癌

EB－鼻咽癌4 检测肿瘤标志物基因或mRNA

肝癌—甲胎蛋白（AFP）结肠癌—癌胚抗原（CEA）肿瘤基因诊疗策略基因诊疗医学知识讲座第43页肿瘤标识物基因检测着丝粒

染色体22bcrgenec-ablgene

染色体9

bcr-mRNA

bcr-abl

mRNA

染色体9,22

bcr-abl

融合蛋白（具PTK活性）

慢性骨髓白血病

引物A引物B基因诊疗医学知识讲座第44页2 癌基因和抑癌基因检测㈠ras癌基因检测ras基因中最常见点突变是第12，13或61密码子突变检测方法：PCR/ASOPCR-SSCP基因诊疗医学知识讲座第45页㈡p53检测p53基因突变主要为点突变，热点区域位于密码子130~290，以175、273、284最多见检测方法：PCR—SSCPPCR—测序PCR—RFLP基因诊疗医学知识讲座第46页㈢其它基因检测PCR结合其它技术基因芯片基因诊疗医学知识讲座第47页4、肿瘤标志物检测或mRNA诊疗肿瘤标志物 是由肿瘤组织细胞产生、与肿瘤形成和发展相关物质，包含肿瘤抗原、激素、酶、同工酶等。基因标志和基因表型标志（胚胎性抗原）检测方法：PCR—ASOPCR—测序PCR—RFLPPCR－SSCP基因诊疗医学知识讲座第48页第四节感染性疾病

基因诊疗基因诊疗医学知识讲座第49页一、感染性疾病基因

诊疗策略针对病原体特异核酸序列设计探针进行杂交应用PCR技术扩增病原体基因保守序列核酸杂交技术与PCR技术联合应用基因诊疗医学知识讲座第50页特点简便、特异、快捷能检测出潜在病原体可对病原体进行分类、分型判定不能得知病原体进入体内后机体反应基因诊疗医学知识讲座第51页二、基因诊疗感染性疾病（一）、病毒特点：分离培养—周期长，操作繁杂，制约原因多电镜观察—直观快速，但昂贵免疫学诊疗—简便快速，但存在问题：不易检出潜伏期病毒有些病毒亚型多，抗原变异性大整合进入人基因组病毒基因诊疗医学知识讲座第52页病毒核酸分析技术HBV—包含4个开放阅读框，S、C、P、X PCR PCR/限制性内切酶谱分析

PCR/点杂交, PCR/Southernblot

基因芯片目标基因引物序列扩增片段C5’ACTGTTCAAGCCTCCAAGCT3’425bp5’AGTGCGAATCCACACTC3’基因诊疗医学知识讲座第53页

调整和开启转录LTRgagpolenv

tat，revLTR

长末端重复序列调整蛋白基因正常病毒基因产生病毒关键蛋白产生逆转录酶和整合酶

产生病毒外膜蛋白附加基因*HIV病毒基因组结构基因诊疗医学知识讲座第54页目标基因引物序列扩增片段env5’ACAATTATTGTCTGGTATAG3’135bp5’AGGTATCTTTCCACAGCCAG3’HIV-1ProbeTGAGTTGCAACAGATGCTGTTGCGCCTCAATAGCCCTCAGPCR/核酸杂交诊疗艾滋病基因诊疗医学知识讲座第55页SARS——RT－PCR

多重PCR

荧光定量PCR基因诊疗医学知识讲座第56页（二）、细菌细菌性痢疾——志贺菌，侵袭性大肠杆菌，大质粒；PCR结核病——PCR

基因诊疗医学知识讲座第57页（三）、寄生虫重复序列探针法、寡核苷酸探针法、基因组探针法、PCR基因诊疗医学知识讲座第58页第五节基因诊疗策略基因诊疗医学知识讲座第59页（一）检测致病基因突变基因变异致病类型：内源基因变异基因结构突变点突变、插入、缺失、重排、异位