m法测定大肠杆菌活菌数的实验研究

m法测定大肠杆菌活菌数的实验研究

其他动物细胞活菌的表达通过研究细菌在土壤中的行为特征，特别是研究引起的微生物对水、土壤和地下水的污染，我们尤其需要了解细菌的活性和数量。常见的细菌计数方法包括平板稀释法、mpn法、血球板计数法、自动细菌数测量法、碱度法、干质量法等。MTT比色法(简称“MTT法”,MTT全称为3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide,中文化学名3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名为噻唑蓝)是1983年由Mosmann提出的一种检测细胞存活与生长的方法(MTT法具有工作量小、操作简便、快速、重复性好等优点,该方法已广泛应用于真核细胞(肿瘤和真菌细胞)活性检测、生物因子活性检测、肿瘤细胞药敏检测、抗肿瘤药物大规模筛选、真菌药敏实验、细胞毒性试验等方面(大肠杆菌是重要的微生物研究材料,也是重要的环境污染指示菌,研究其活菌菌数的测定方法是一项重要工作.由于很多科学研究过程中需要实时了解细菌的数量变化及存活情况,而平板稀释法测活菌数时工作量大、耗时长,不能满足实验的要求.因此,本文在参考相关研究的基础上,针对现用于动物细胞活细胞计数的MTT法,系统研究各种影响因素(工作波长、不同干扰物、反应时间、MTT用量、DMSO、菌龄)对MTT法测定的影响,探究用MTT法快速准确检测大肠杆菌活菌数的方法.杏仁2.1实验用仪器试验用细菌为大肠杆菌,购自天津科技大学微生物菌种保藏管理中心.培养基:10g蛋白胨,5g氯化钠,3g牛肉膏,1000mL蒸馏水.MTT溶液:称取100mgMTT于50mL小烧杯中,加20mLPBS(0.0lmol·L实验用仪器包括全自动酶标仪、96孔板、灭菌锅、培养箱、水浴摇床、pH计、冷冻离心机、微量离心机、移液枪和超净工作台.2.2方法2.2.1细菌培养取浓度为102.2.2最适检测波长及条件确定MTT比色法测定活菌数量时,首先需要确定最佳工作波长、有效测定范围、各种干扰物的影响、最佳反应条件及标准曲线的制备等.吸收峰确定:将菌悬液按1∶2、1∶4比例稀释,取原液和稀释菌液,加入96孔平底培养板中,每孔100μL,并按每孔20μL加MTT溶液,放于37℃恒温箱中(大肠杆菌为原核细胞,其最适生长温度为37℃,因此,琥珀酸脱氢酶与MTT反应温度为37℃,在此温度下酶的活性最大,有利于反应的进行),60min后取出,加100μLDMSO后测定波长400～700nm范围内间隔5nm的光密度值(OD),以OD最大时的波长作为最适检测波长.空白为100μL生理盐水+20μLMTT+100μLDMSO.各浓度至少3个平行.干扰物对测定结果的影响:对实验过程中接触到的介质进行干扰实验,以DMSO为参比,将灭菌培养基、死菌体(将活菌液在100℃水浴中煮30min)、生理盐水作为干扰物,用MTT法分别测定吸光值.每组实验至少6个平行.测量范围的确定:取菌悬液按10倍浓度稀释9个梯度,用MTT法测定不同浓度菌液的OD,分析该方法的测定范围.最佳反应条件的确定及标准曲线的绘制:将菌悬液对倍稀释,测原样、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128和1∶256各稀释菌液的OD.将稀释液加入到96孔平底培养板中,每孔100μL,各做5个复孔.按每孔10μL或20μL加入MTT溶液,放入37℃恒温箱中分别于20、40、60、90min后取出,在不加入和加入100、150μLDMSO的条件下,测定最佳波长下的OD.同时用平板计数法测定各稀释度下的菌落数,建立菌落数与OD间的关系(方案见表1).不同菌龄细菌的影响:将大肠杆菌分别培养12h(对数生长前期)、24h(稳定生长期)、36h(稳定生长末期)后采用MTT法测量OD,平板法测定活菌数.绘制细菌浓度显著3.1吸收峰的确定图1为3种浓度菌液(原液、1∶2和1∶4稀释液)与MTT反应后的波长扫描图.从图1可以看出,甲臜在520～620nm范围内有较宽广的吸收峰,没有明显的特异性吸收峰,且不同浓度菌液条件下的吸收峰也有一定变化.分析原因可能有:①实验过程中使用的试剂,如MTT、DMSO可能在400～700nm范围内有特异性的吸收峰,对甲臜的吸收产生干扰,因此,需要对实验试剂的吸收峰加以测定;②MTT与细菌产生的脱氢酶反应不完全,甲臜形成的量较少,因此,增加MTT与细菌反应时间,使反应更加完全;③实验过程中发现,加入DMSO后沉淀溶解分散在整个反应体系中,但随着放置时间的延长,培养板底部又重新积聚黑色沉淀,上清液颜色渐浅,因此,反应体系的不均匀也会导致扫描结果的不确定性.所以,需要增加DMSO的用量,让甲臜完全溶于DMSO内,使整个反应体系均一.3.1.1测定波长m的测定以生理盐水+DMSO为空白,生理盐水+MTT+DMSO作为MTT检测,用MTT法在400～700nm范围内测定各个波长下的吸光值;同时,以超纯水为空白,检测DMSO在400～700nm的吸收峰,扫描结果见图2.从图2可以看出,MTT仅在410nm处有一峰值,峰尾在480nm处.DMSO在400～700nm间的吸收极小,基本可以忽略.由此可知,MTT与DMSO本身对甲臜的吸收没有影响.3.1.2dmso用量对吸收峰的影响图3为20μLMTT溶液与0μLDMSO或100μLDMSO在反应时间为20、40、60、90min条件下的波长与OD关系.表2为各反应时间及加入不同DMSO量条件下的吸收峰对比.显然,从图3可以看出,加入DMSO为0μL条件下,随着反应时间的延长,甲臜的吸收峰无变化,维持在650nm处;但OD值却有差异,其中,反应60min后的OD值最大.而加入DMSO100μL,不同反应时间的最大吸收峰略有变化,但其波型一致,均平缓,在500～610nm范围内有宽阔的吸收峰;反应90min后,OD值达到最大.由此可以看出,反应时间对甲臜的吸收峰没有影响,但对OD值有明显的影响.3.1.3dmso的用量对比3种DMSO用量条件下的OD值发现,不加DMSO的反应体系呈蓝绿色,加入DMSO后反应体系呈紫色,增加DMSO的用量使甲臜颗粒在整个反应体系中的溶解量增加,紫色越深,甲臜溶解越完全.从图1及表2可见,加入DMSO后,甲臜的吸收峰由单一的650nm,分散为多个不同的吸收峰(515、570、610nm);由一个较为明显的峰值变为平缓的吸收区域,且OD都有所下降;增加DMSO的用量后,吸收区域的分布范围变窄,基本分布在500～570nm之间(加入100μLDMSO,吸收区域分布在500～650nm之间);吸收峰主要分布在530、570、640nm处,向左发生了偏移,在510nm处产生了比较明显的吸收峰.并且不同浓度吸收峰差异不大,基本稳定在510nm和570nm处.通过以上实验发现,甲臜在510～650nm处有比较宽的吸收峰,在510、570、640nm处有最大的吸收.该结果与已有的实验结果基本吻合(魏洪刚等,2002).3.1.4甲溶解体系以上实验分析显示,反应时间只影响OD值,与最大吸收峰的位置无关;而是否使用DMSO及使用量对吸收峰有比较明显的影响.在实验过程中,甲臜处于水和DMSO的混合体系,两种液体会相互干扰影响甲臜溶解,进而对其吸收峰产生影响;此外,随反应时间的延长会使得甲臜颗粒在液相体系中重新聚集.因此,为消除影响,在反应完全后,12000r·min由图4和表3可以看出,离心后使原方法(见2.2.2节所述)扫描的吸收曲线在510～630nm之间有较宽的吸收区间,并出现了具有特异性、单一的吸收峰,且该吸收峰不随菌液浓度的变化而改变,有良好的稳定性.综上,MTT方法测量大肠杆菌活菌数时,最大吸收峰为510nm.3.2干扰物的影响各干扰物对MTT法测定的吸光值的影响如表4所示.从表中发现,不同干扰物对MTT法均有影响,其中,无菌培养基与无菌生理盐水的影响较小,而死菌体(沸水浴中加热30min)对实验的影响很大,OD3.2.1消毒时间和od表4显示了灭菌30、40、50、60min后MTT法检测的OD3.2.2甲吸收波长的确定采用上述扫描波长改进方法,加MTT法(200μL)振荡均匀,灭菌60min,12000r·min由图4可知,甲臜在690nm以上吸收值很小.取690nm为参考波长,空白为DMSO,用甲臜的OD3.2.3干扰物测定od综合考虑各种干扰物的影响,以DMSO为参比,空白板、生理盐水、上清液、死菌体(100℃水浴60min或高压灭菌30min)、灭菌培养基作为干扰物测定的OD3.3测量距离的确定将菌悬液按10倍浓度稀释9个梯度,测定其OD3.4最佳反应条件的确定不同菌种因活性不同,其反应时间也不一样.将菌悬液对倍稀释,分别稀释为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128的稀释液,分别取菌悬液1mL加入到微量离心管中,加入MTT溶液(100μL和200μL)振荡均匀,37℃分别反应20、40、60、90min,然后加入1mL的DMSO,并消除各干扰物的影响后立即测定OD由图5和表8分析可知,在测量范围内,实验过程中发现,加入100μL和200μLMTT溶液,反应一定时间后上清液分别为白色和黄色,这说明加入100μLMTT溶液时,MTT反应尚不完全,可能造成MTT与脱氢酶反应不完全.综上分析,加入200μLMTT溶液,反应60min后反应体系分散较为均一,且有较好的线性关系,可作为MTT方法的最佳反应实验条件.3.5不同菌体细菌对mtt法的影响由于实验中加入的MTT是过量的,因此,MTT与琥珀酸脱氢酶的氧化还原反应所生成的甲臜量取决于琥珀酸脱氢酶的量与活性.对于不同生长阶段的细菌来说,其琥珀酸脱氢酶的量与活性可能会不同.因此,分析不同生长阶段的细菌对MTT法的测量结果的影响是必要的.将大肠杆菌培养12h(对数生长前期)、24h(稳定生长期)、36h(稳定生长后期)后,用MTT法测定OD图6和表9显示,菌体在不同生长阶段OD实验结果的一致性1)研究表明,双波长MTT法测定大肠杆菌活菌数可获得