鸡胚成纤维细胞感染马立克氏病后部分染色体上微卫星的变化

鸡胚成纤维细胞感染马立克氏病后部分染色体上微卫星的变化

马立克病（mdv）是由马立克病病毒（mdv）引起的一种严重的鸡淋巴肿瘤性疾病。mdv感染可能会导致主观免疫抑制。这是目前和将来最重要的鸡育种疾病之一。微卫星(microsatellite,MS)是广泛存在于原核及真核细胞基因组中的简单串联重复的DNA序列,约占人类基因组的10%1材料和方法1.1实验用微卫星引物实验所用鸡胚购自南京药械厂;马立克氏病毒超强毒株RB-1B株,由南京农业大学动物医学院动物免疫诊断与免疫重点实验室惠赠;本实验中所用的微卫星引物由日本农业生物科学研究所惠赠;小牛血清、MEM由Gibco公司生产;胰蛋白酶购自华美生物工程公司;Taq酶,PUC18DNA/MspI,购自南京天为生物科技有限公司;尿素、过硫酸铵、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、硼酸与Trisbase,TEMED由Amresco公司生产;AgNOCO1.2马立克病毒对鸡胚细胞生长的影响取21个孵化9~11日龄SPF鸡胚,按常规鸡胚成纤维细胞培养。待细胞大约80%铺满细胞培养瓶壁时,来自同一鸡胚个体的CEF一半接种马立克病毒超强毒株RB-1B株,一半不接毒作为对照。攻毒后第5天,有90%的细胞出现典型的细胞病变时,收集细胞,采用常规的细胞基因组DNA提取法提取DNA1.3pcr扩增试验提取的DNA作模板,用鸡5,6,7,8,9号染色体上的43对微卫星引物,进行PCR扩增采用25μL的反应体系:基因组DNA(大约50ng/μL)1μL,引物(10pmol/μL)1μL,Taq酶1.25U,10×PCR缓冲液(Mg首先94℃,预变性1min15s,采用循环三相。第一相共10个循环,94℃变性15s,60℃退火30s,68℃延伸1min。第二相共10个循环,94℃变性15s,55℃退火30s,68℃延伸1min。第三相共30个循环,94℃变性15s,50℃退火30s,68℃延伸1min。最后68℃延伸9min。1.4聚丙烯酰胺变性凝胶电泳取4μLPCR扩增产物,上样至10%聚丙烯酰胺变性凝胶内,160V电压电泳2~3h,电泳凝胶银染,成像系统拍照分析结果。1.5pcr扩增效果目前国际MSI工作站推荐一组检测微卫星标志物至少应为5个,其中有≥2个标志物发生MSI时为MSI-H,1个标志物发生MSI时为MSI-L,没有MSI发生时为MSS判断样本是否有MSI:比较同时电泳上样的染毒CEF和其同源正常CEF基因组DNA的PCR产物的PAGE条带,与正常对照相比,若某一微卫星位点的等位基因条带增多或位置发生改变,则记为MSI。2结果与分析2.1纤维细胞培养的结果待CEF细胞贴壁长成单层,大约有80%铺满底壁时(图1),接毒超强毒株RB-1B株,在CO2.2聚丙烯酸-冷凝胶电泳的结果同一个引物不同样品的电泳图。2.3微卫星标记多态性检测由表1可见,5,6,7,8,9号染色体的43个微卫星标记,其中38个位点发生不同百分率的MSI,5个标记没有检测到变化,占微卫星标记5/43(11.63%)。检测到有MSI的微卫星位点表现不同的百分率,其中ABR0262的MSI发生率最高为38.10%,ABR0048,ABR041,MCW0183次之,其MSI均为33.33%。MSI最低为4.76%,这样的位点有7个,占微卫星标记的比率为7/43(16.28%)。2.4样品制备方法hdmi由表2可见,21组样品中,9号样品,MSI发生率最高为41.86%。11,6号样品的发生率也较高,分别为32.56%,27.91%。3组样品检测到MSI的发生率为25.58%;1组样品检测到MSI发生率为16.28%;1组样品检测到MSI发生率为11.63%;4组样品检测到MSI发生率为9.30%;6组样品MSI发生率为6.98%;1组样品检测到MSI发生率为4.65%;2组样品的MSI发生率最低为2.33%。10个位点MSI的发生率在20%以上,占总微卫星标记的10/43(23.26%);21组鸡胚19组出现两个或两个以上位点出现基因组变化。3种病毒在色体上的微卫星不稳定性微卫星不稳定性(MSI)与肿瘤之间的关系是近年来肿瘤学研究的热点之一,产生MSI的机制及其与肿瘤发生关系的研究已取得很大进展。MSI是基因组不稳定性的标记,它在MSI肿瘤细胞增殖期间逐渐发展的一个动力学过程本实验通过对鸡胚成纤维细胞感染马立克氏病毒后部分染色体上微卫星不稳定性研究发现,宿主基因组微卫星不稳定性的变化是随机的,但也有一定的规律,而且这些变化可以用微卫星标记来检测。5,6,7,8号染色体上43个微卫星位点MSI的发生频率存在差异。43个位点中,ABR0262的MSI发生率最高为38.10%,ABR0048,ABR041,MCW0183次之,他们的MSI均为33.33%。MSI最低为4.76%,这样的位点有7个,占微卫星标记的比率为7/43(16.28%)。10个位点MSI的发生率在20%以上,占总微卫星标记的10/43(23.26%);21组鸡胚中19组出现两个或两个以上位点出现基因组变化。夏继飞由于检测的位点和数量不同,不同染色体上或同一染色体上不同位点间MSI频率差异可能很大。MD可能是MSI瘤,马立克肿瘤的发生、发展涉及不同基因的多部位、多步骤的改变。本实验中MSI率与以前研究结果4mdv致瘤机理解析微卫星标记研究能够揭示MDV感染宿主后的致瘤机理。微卫星标记可以揭示宿主基因组尤其是肿瘤基因组发生了哪些变化,特别是对错配修复基因突变的探查,动态的研究还能了解变化的顺序及过程。故而针对宿主的基础研究结合病毒功能基因组的研究成果,就比较容易解析MDV感染宿主后的致瘤机理。肿瘤的发生发展与染色体数量、结构异常密切相关,分析某种肿瘤高频率的染色体改变将为肿瘤易感基因的筛选提供定位资料。MD是由MDV引起的肿瘤性疾病,在发病前如能监测或诊断出MDV致瘤株的感染,对避免鸡场的损失非常关键。事实上,MD肿瘤的形成是本病的关键所在。在肿瘤形成前作出诊断是目前MD研究所缺乏的。本试验中筛选到的