克氏原螯虾黑鳃上木谋发生防菌木谋刀菌的分离鉴定

克氏原螯虾黑鳃上木谋发生防菌木谋刀菌的分离鉴定

木贼镰刀菌（corda）sac。1886年，这是一种常见的世界真菌，也是一种不同于原头虾（通常被称为小龙虾）在黑枝上的一种真菌。小龙虾是该菌的新主人。之前尚未有在温带至热带地区的小龙虾中发现该真菌的报道。最近几年的研究发现，在小龙虾养殖地区，由镰刀菌属(FusariumLinkexFr1809)引起的小龙虾黑鳃病(blackgilldisease)普遍发生，常常造成小龙虾死亡。黑鳃病又被称为镰刀菌病害(Fusariumdisease)在对螯虾科(Astacidae)和拟螯虾科(Parastacidae或Austroastracidae)虾类的研究报道中，茄镰刀菌[Fusariumsolani(Mart.)Sacc1881]为了更好地预防和控制小龙虾黑鳃病的发生和传播，首先要准确鉴定病原。本研究在实验室条件下的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上，对感染小龙虾黑鳃病的病虾鳃片进行分离培养和纯化，得到了1个镰刀菌菌株，并通过形态学观察描述和DNA分子测序对其进行了种类鉴定，以期对小龙虾养殖和病害防控提供新的依据。1材料和方法1.1来自来源2018年6月13日，在江苏省句容市润泰生物科技有限公司养殖基地采集患黑鳃病的小龙虾样本，装入标本袋，放在4℃低温冷藏箱备用。1.2真菌的分离纯化将病虾的黑鳃用自来水冲洗后，再放在灭菌水中清洗3次，取出，用灭菌纸吸干鳃上的水分，用灭菌的剪刀将病鳃片剪下，在无菌条件下转移到盛有马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基的培养皿内，放在(25±2)℃的PRX-250A型智能人工气候箱内(RH70%，黑暗)培养。用此方法共分离20皿120块黑鳃组织，4d后取出检查，统计分离结果。对不同颜色的真菌菌落分别进行纯化、编号。本研究中的菌株标号为NLHf-3。对此次分离到的细菌不做进一步研究。1.3菌落生长情况观察将NLHf-3菌株接种到PDA平面培养基上，培养7～10d(培养条件同1.2)，观察菌落的生长情况。将NLHf-3菌株接种到灭菌载玻片上的PDA培养基上1.4菌株4号菌株pcr扩增测序试验该真菌的DNA提取、PCR扩增和测序反应的方法和步骤由南京金斯瑞生物科技有限公司协助完成。测序菌株代号为174(保存菌种NLHf-3，即黑鳃病真菌3号菌株)。测序试验流程:(1)设计特异性引物。引物名称为ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG),ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC);(2)提取基因组DNA;(3)合成引物，扩增ITS区全序列，扩增;(4)PCR产物纯化，即使用胶回收方法进行PCR产物纯化;(5)使用ABI3730XL测序仪对PCR产物进行测序;(6)在GenBank数据库中，通过NCBI的Blast检索系统进行序列同源性比对。2结果2.1真菌菌落组成在120块黑鳃组织(见图1)上共得到真菌菌落73个，占60.8%;细菌菌落47个，占39.2%(本文不进行研究)。经初步鉴定，73个真菌菌落隶属于5属7种，其中包括木贼镰刀菌。其他的分离结果在本文中不进行讨论，另外单独发表。2.2分子n,n-Fusariumequiseti(Corda)Sacc.,Syll.fung.(Abellini)4:707(1886)MycoBankNumber:199819。异名(Synonymy):SelenosporiumequisetiCorda,Icon.fung.(Prague)2:7(1838);Fusariumequisetivar.crassumWollenw.,Fusariaautographicadelineata3:no.921(1930)。木贼镰刀菌种以下的分类单位有2个亚种，7个变种和3个专化型。2.2.1大分生孢子及芽孢杆菌生长在PDA培养基上[(25±2)℃，RH70%]，菌落呈淡米黄色、疏松、棉絮状(见图2)，平均日生长量约为1.1cm。分生孢子梗单生(见图3)、具分枝，其上着生倒棍棒状的瓶梗，大小为(12.0～17.0)μm×(3.0～4.0)μm;大分生孢子形状变化大，呈纺锤形或镰刀形，3～5个分隔，具有明显的基细胞，或稍弯曲，孢体中间宽、两端渐收窄(见图3)，大小为(31.0～47.0)μm×(4.0～5.0)μm;在PDA上小型分生孢子少。在菌丝上有厚垣孢子形成，单生或串生(见图4)，表面较粗糙，呈球形或近球形，直径为7～9μm。在人工培养基上不产生有性世代。2.2.2sapst-pcr扩增片段中整合体的分析通过对NLHf-3菌株的菌丝进行DNA提取，用ITS1和ITS4的通用引物进行PCR扩增，得到长度为529bp的特异性DNA片段。扩增ITS区全序列，结果见图5。通过对扩增片段进行测序，用NCBI的Blast检索系统在Genbank数据库中搜寻相似序列，结果与库中登录号为MH290363.1和KY910876.1(包括小亚基核糖体RNA基因，部分序列;ITS15.8S核糖体RNA基因，ITS2完整序列;大亚基核糖体RNA基因，部分序列)的同源性均为99%，因此可以确定小龙虾黑鳃上的真菌菌株为木贼镰刀菌(Fusariumequiseti)。2.2.3四种昆虫形态的比较除了木贼镰刀菌外，在小龙虾黑鳃上还有茄镰刀菌、尖孢镰刀菌、肉红色镰刀菌等其他3种镰刀菌的报道3不同种类木排放的粒径小龙虾对病害的影响木贼镰刀菌作为小龙虾体上微生物成员的1种，在我国属于首次报道。现已发现有多种镰刀菌(Fusariumspp．)能侵染虾类，如小龙虾、欧洲高贵小龙虾(Astacusastacus)、土耳其小龙虾(A.leptodactylus)、白爪小龙虾(Austropotamobiuspallipes)、信号小龙虾(Pacifastacusleniusculus)和西墨兰丝螯虾(Procambarussimulans)镰刀菌导致小龙虾病害的主要原因是镰刀菌在生长过程中会产生多种毒素，对动物机体造成病理性损伤，抑制免疫机能，诱导细胞凋亡，如镰刀菌T-2毒素(T-2Toxin)会引起白细胞减少症，使造血系统功能衰退。如果小龙虾被木贼镰刀菌感染，木贼镰刀菌所分泌的毒素会对小龙虾的细胞产生不良影响，从而引发病害。木贼镰刀菌是动植物的病原菌，能分泌格链孢酚(Alternariol)、交链孢酚单甲醚(Djalonensone)、腺嘌呤核苷和过氧麦角甾醇镰刀菌是一类机会主义病原菌，也被称为兼性寄生病原菌，在大多数情况下以腐生的方式依附在小龙虾上，当小龙虾受伤后或虾体免疫力下降时即可变成病原菌侵染小龙虾，引发