杜仲叶片光合色素含量测定方法的比较

杜仲叶片光合色素含量测定方法的比较

杜仲是中国特有的经济树种，也是各种含有橡胶的木本植物之一。目前，它是国家战略储备资源和广阔的发展前景。1材料和方法1.1apos试验材料为国家林业局泡桐研究开发中心原阳基地(东经113°34'~113°52',北纬34°53'~35°05')杜仲良种繁育圃1a生‘华仲7号’杜仲嫁接苗.选择位置相同,色泽一致成熟叶片10片,用直径3mm打孔器在避开叶脉处取样若干,立即放入冰盒带回实验室进行光合色素含量测定.1.2%5g/g在所取样品中随机选择20个(约0.1g)精确称量后分别采用研磨法每个处理重复3次.对样本和比色皿进行编号,保证测得数据的前后对应以降低系统误差.样品采集后用滤纸吸干表面水分后测定其鲜重,精确到0.0001g;浸提后在室温下放置30min,待液体完全蒸发后测定其浸提后重量,精确到0.0001g.分别在研磨后6,12,18,24h及36h和浸提后24h及36h采用移液管量取3mL浸提液在安捷伦Cary300紫外分光光度计470,645,663nm下进行测定.每个处理读取2个数据以其平均值进行光合色素含量计算.光合色素含量计算公式为:式中:C因浸提法各浸提液在24h存在光合色素浸提不完全的情况,所以此时吸取了3ml浸提液后,致使36h所得光合色素浓度因体积的减小而增大,因此需将36h所得光合色素浓度进行转换,转换方法为:式中:C为光合色素浓度(mg·g1.3数据处理方法使用SPSS16.0软件进行方差分析和配对样本的t检验.2结果和分析2.1采用研磨法和提取法不同处理叶片研磨酶的含量研磨法和浸提法不同浸提液各时间所测的杜仲叶片光合色素含量如表2所示.C2.2随着时间的推移，研磨法中的钙含量发生了动态变化规律研磨法各浸提液不同时间段叶片光合色素含量配对样本T检验结果如表3所示.由表3知,C2.3均无明显规律经方差分析和多重比较,研磨法各时间段所得光合色素含量不同浸提液间均无明显规律;但浸提法24h及36h所测得的光合色素含量均为3号浸提液最高,2号浸提液其次,4号浸提液最低.该结果说明3号浸提液浸提速度最快,其次为2号浸提液.3号浸提液浸提36h,C2.4不同浸提液的制备结果对36h浸提法和研磨法所得光和色素含量进行方差分析和多重比较.结果表明,研磨法各种浸提液所得结果均显著高于浸提法,加之光合色素的分解引起测定值下降,所以推荐杜仲光合色素的测定方法采用研磨法.2.5浸提液与光合色素的比例关系在研究过程中,发现不同浸提液及浸提剩余物颜色发生变化,随着浸提时间的增长,浸提物颜色逐渐加深,浸提结束后浸提液颜色及浸提剩余物重量和颜色如表4所示.浸提剩余物颜色深浅与浸提液中水的比例存在一定关系,水分比例越大,颜色越黑,水分比例小,颜色浅,无水分时,则颜色为灰白色.光合色素浸提液中颜色深浅不一,结合光合色素含量的测定结果和浸提物重量及颜色,认为杜仲叶片中某种物质与水(或者溶于水的物质)产生了某种未知反应.至于色素是未被完全浸提出来还是发生了某种反应,本研究尚无法得出结论.对浸提前后浸提物差值进行方差分析,结果表明,单一浸提液(95%乙醇和80%丙酮)间无显著差异,混合浸提液(乙醇∶丙酮=1∶1和乙醇∶丙酮∶水=4.5∶4.5∶1)间无显著差异,而单一浸提液和混合浸提液间存在显著差异.该结论与前文中光合色素含量的结果一致,证明了混合浸提液在光合色素提取中的优势.另因丙酮∶乙醇∶水=4.5∶4.5∶1浸提液与叶片发生了未知反应,所以建议浸提采用丙酮和乙醇(体积比为1∶1)混合溶液.3结论和讨论3.1提取过程的选取从研究的结果可知,各浸提液由研磨法所提取的杜仲叶片光合色素含量在36h内均显著高于浸提法,随着研磨后光合色素含量分解增多及浸提法的继续浸提效果,2种方法差距逐渐变小.因浸提出的光合色素随着放置时间的延长,会存在因分解而造成测定结果偏低,所以浸提法从原理来讲不及研磨法,但研磨法操作较为繁琐,中间环节较多,容易产生系统误差.本研究研磨法测定变异系数大于浸提法也说明了此问题,所以研磨法必须严格按照操作流程进行.本研究所用浸提材料的体积稍大,浸提速度较慢,在24h内4种浸提液均未能完全提取光合色素,但却有效的说明了不同浸提液浸提速度快慢.在某些特殊的试验要求必须采用浸提法提取光合色素时,建议浸提材料体积尽量小,同时先做预备试验,确定在该体积下的最短提取时间,以降低误差.3.2浸提剩余物的颜色对杜仲叶片光合色素浸提速度最快的是3号浸提液(丙酮∶乙醇∶水=4.5∶4.5∶1),但叶片浸提剩余物颜色的差异说明在浸提的过程中发生了某种未知的反应,且浸提剩余物的颜色随着溶液中水含量的增加而加重,说明了浸提液中的水分含量可能会对光合色素含量测定造成影响.杨敏文3.3杜仲叶片光合色素含量的测定本研究结果表明,研磨法