蚯蚓激酶及其口服油包水wo型微乳制剂对大鼠肝纤维化的影响

蚯蚓激酶及其口服油包水wo型微乳制剂对大鼠肝纤维化的影响

中国是世界上受影响最大的肝脏疾病之一。慢性肝炎和肝硬化是许多和不可避免的。肝纤维化是指肝细胞发生坏死及炎症刺激时,肝脏内纤维结缔组织异常增生的病理过程,轻者称为肝纤维化,重者进而使肝小叶结构改建、假小叶及结节形成,称为肝硬化。这个由“肝炎→肝纤维化→肝硬化”组成的“三步曲”是各种慢性肝病导致严重后果的共同途径。随着医学分子生物学技术的应用,已明确提出肝纤维化完全有可能逆转的论点。因此,肝纤维化的研究成为世界医学的热点课题。近年来,国内外尤其是国内已有多篇文章论述了中药在抗肝纤维化的基础和临床方面有显著的疗效。地龙是我国传统的中药材,蚓激酶是其主要的活性成分,具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶,对纤维蛋白有特殊亲合力,有利于血栓的防治,已广泛用于脑梗塞的治疗。本实验将蚓激酶及其口服微乳制剂用于大鼠肝纤维化,观察其预防肝纤维化形成的作用。1材料和方法1.1动物雄性SD大鼠46只,体重160±10g,购自河南省实验动物中心(动物许可证号:SCXK(豫)2010-0002)。1.2药物、试剂与仪器四氯化碳CCl4(上海四星医药科技工贸公司出品);精制花生油(山东鲁花集团产品);蚓激酶(江中药业股份有限公司);辛癸酸甘油三酯(LabrafacCC)、聚乙二醇辛癸酸甘油酯(Labrasol)、聚甘油-6-二油酸(PlurolOleiqueCC497)(上海三齐医药科技有限公司);1mL、2mL和50mL一次性注射器若干。1.3w/o型微乳体系的合成称取一定量的蚓激酶溶解于生理氯化钠溶液中,将油相(LABRAFACCC中链甘油三酯)、表面活性剂(LABRASOL辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯)、助表面活性剂(PLUROLOLEIQUECC497聚甘油脂肪酸酯)、以及蚓激酶生理氯化钠溶液按重量比27∶9∶9∶5混合后轻轻搅拌,即得透明均一的W/O型微乳体系。1.4组m组,4.2试验方法46只大鼠随机分成5组:正常组(N组,6只),正常饮食,自来水;阴性对照组(NC组,10只),单蒸水灌胃,花生油皮下注射;模型组(M组,10只),单蒸水灌胃,皮下注射40%CCl4精制花生油溶液混合液,首剂为75%CCl4花生油混合液0.5mL/100g,以后0.2mL/100g,每周2次,共8周;蚓激酶组(Y组,10只),蚓激酶单蒸水溶液灌胃,蚓激酶用量25mg/(kg·d),造模方法同M组;蚓激酶微乳组(YR组,10只),蚓激酶微乳灌胃,蚓激酶用量25mg/(kg·d),造模方法同M组。所有药物均现配现用,每只大鼠用药前均称体重。1.5心功能检测组存活大鼠均于第八周末处死,取全血,室温下静置4h,4℃离心,4000转,15min,每份标本取血清2mL置于4℃冰箱内,作肝功能指标检测。取同一部位切除的肝脏于10%中性缓冲福尔马林液中固定,石蜡包埋,切片。1.6肝纤维化分级①肝组织切片纤维化程度分级:大鼠肝组织经10%中性缓冲福尔马林液中固定、取材、酒精梯度脱水、石蜡包埋、切片,厚度为4μm,作HE染色(苏木素-伊红染色)肝纤维化程度分级。肝组织切片行苏木精-伊红染色,将肝纤维化分为一～++++级:“一”为无成纤维细胞增生,“+”为小叶内细纤维间隔偶见,汇管区扩大无隔;“++”为小叶内细纤维间隔易见,汇管区扩大有隔;“+++”假小叶形成,隔致密较宽,小于半个高倍视野;“++++”假小叶明显,纤维隔较宽,大于半个高倍视野。②血清ALT、AST及AST/ALT检测:以含20μL肝素试管采集全血,离心获取血清,用ALT和AST试剂盒说明书测定血清ALT和AST活性,计算AST/ALT值。1.7统计处理计量资料以x¯±sx¯±s表示,多组间均数比较用单因素方差分析,等级计数资料用秩和检验,采用SPSS13.0统计软件分析。2结果2.1鼠精神状况N及NC组大鼠发育良好,活泼好动。M组大鼠精神差,活动少,发育迟缓,皮毛松驰,毛黯淡,消瘦。Y及YR组动物健康状态相对较好,皮毛柔顺有光泽,灌胃时较凶猛。2.2肝组织病理学观察造模结束时,与N和NC组相比,M组肝组织表面光亮度下降,颜色灰暗,边缘不规则、质脆,肝表面可见粗细不等的结节。Y、YR组肝组织红润,呈花斑状,柔软,未见明显结节。2.3y、yr组不同时间点岩细胞增殖情况HE染色显示M组主要为肝细胞坏死、小叶结构破坏、炎性细胞浸润及纤维结缔组织增生、纤维分隔包绕和假小叶形成,Y、YR组以肝细胞变性为主,肝细胞坏死、炎性细胞浸润及纤维结缔组织增生较M组明显减轻(P<0.05),且YR组优于Y组(P<0.05)(见表1)。2.4血清ast/alt的比值对判断肝纤维化和插装置加工的影响血清AST和ALT被认为是肝细胞损伤最敏感指标,但其升高幅度与肝病严重程度不一定平行。血清AST/ALT的比值对肝纤维化和肝硬化等病理改变,有助于判断肝细胞病变的程度。比值越高,说明肝细胞损害越严重。Y、YR组与M组相比血清AST/ALT的比值明显降低(P<0.05),且YR组优于Y组(P<0.05)(见表2)。3纤溶酶原-纤维组织及抑制剂的作用本实验结果显示,与模型组相比,蚓激酶组及蚓激酶微乳组一般情况较好,肝纤维化程度明显减轻,血清AST/ALT的比值明显降低。说明蚓激酶对实验性大鼠肝纤维化模型有抑制作用。同时,我们发现蚓激酶制备成W/O型微乳后,能明显提高疗效。目前认为,肝纤维化是多种致病因子使肝星状细胞(HSC)激活后,纤维生成与降解失去平衡所致,纤维生成超过了纤维降解,细胞外基质(ECM)便过度地在肝脏沉积。有研究表明在肝纤维化的发生发展各个阶段中纤溶酶原-纤溶酶系统发挥了重要的作用。纤溶酶是主要的蛋白分解酶,纤溶酶既可以直接降解ECM,也可以激活基质金属蛋白酶(MMPs),参与ECM的降解。蚓激酶是具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶,关于蚓激酶抑制肝内纤维组织的形成及其相关机制尚需进一步研究。前期研究表明,蚓激酶在pH