基因工程演示文稿

基因工程在转基因食品中的应用

以植酸磷为唯一磷源生长的转基因甘蓝型油菜

小组成员：张莉娟，王暗唐亚楠，蒋俊利磷在土壤中由于强吸附作用、低溶解性以及难移动性等因素的影响，使得其有效性很低，因此成为限制植物生长的重要因子之一。在酸性和碱性土壤中，磷主要以植物难以直接利用的难溶性磷存在，其中有机磷占上壤总磷量的50%-80%，其中有机磷的20%~50%是植酸磷

。在大豆、油菜、玉米等主要农作物种子中磷的基本存在形式也

是植酸磷。植物只能吸收利用无机磷,有机磷只有在植酸酶的作用下分解释放出无机磷后才能被吸收利用。植酸酶(phytase)是一种能水解植酸的磷酸酶类,在一定条件下能将植酸分解成为肌醇和磷酸。自然条件下,植物根系能分泌有机酸和少量磷酸酯酶(主要是植酸酶),降低根围土壤pH,促使土壤难溶性矿物磷酸盐的溶解和水解土壤中的植酸和其他有机磷, 释放出无机磷供植株吸收利用。但研究表明,植物通过这两种方式吸收利用土壤中植物难利用磷的能力很弱,植物本身并不能大量产生胞外植酸酶。甘蓝型油菜是我国重要的油料作物,甘蓝型油菜又是对磷素很敏感的作物,土壤缺有效磷可引起减产,开展甘蓝型油菜磷素营养高效利用遗传改良、筛选和培育油菜磷利用高效品种,是解决土壤缺磷的有效途径之一。Ponstein等将来源于A.niger植酸酶phyA基因转移到油菜籽中,用种子特异性启动子CruA控制phyA,并在植酸酶成熟肽前加上十字花科信号肽序列,结果发现95%的油菜籽中检测到植酸酶的活性。研究原理：以油菜具柄子叶为外植体,应用农杆菌介导的方法,将具有胞外分泌信号肽序列的植酸酶基因转入甘蓝型油菜。通过植酸酶在植株根系中表达并分泌至胞外,使植株根系分泌物中含大量高活性的植酸酶以水解土壤中的植酸,释放出磷供植株吸收利用。探索通过基因工程技术提高油菜对土壤有机磷的利用效率,建立土壤有机磷→植物可利用的无机磷→植物储存的有机磷→土壤有机磷的植物磷素营养循环利用的环保型新途径。材料与方法

1.试验材料：受体材料是由中国农业科学院油料所选育的甘蓝型油菜品种中双6号。根癌农(Agrobacteriumtumfaciens)菌株LBA4404。植物表达载体pBINPR-phyI为含带胞外分泌信号肽序列的植酸酶基因和NPTⅡ基因。检测植酸酶基因所用引物。植物表达载体如图

植物表达载体pBINPR-phyI构建图谱2外植体的选择和农杆菌菌液的制备

饱满的中双6号种子消毒,植入1/2MS培养基生长3~4d,从子叶节上1mm处切下具柄子叶作为外植体。将一含有植物表达载体的农杆菌单菌落划线于含50mgL–1kan的YEB固体培养基上,28℃培养1~2d,用1/2MS液体培养基(pH5.4)洗下菌体,并将菌液稀释至OD600＝0.08,作为侵染用菌液。3根癌农杆菌介导转化甘蓝型油菜将油菜具柄子叶置侵染用农杆菌菌液中,22℃侵染5~10min,其间轻轻摇动。捞出后在无菌吸水纸上吸干菌液,将子叶转至MS+1mgL–12,4-D+0.2mgL–16-BA培养基上,22℃暗培养2~3d,然后转移到MS+4.5mgL–1BA+5mgL–1AgNO3+500mgL–1Cb(羧苄)上延迟培养5~7d,再转至筛选培养基MS+4.5mgL–1BA+5mgL–1AgNO3+500mgL–1Cb+10~20mgL–1kan上培养2~3周,待再生绿苗长至1~2cm时,切下,植入生根培养基MS+0.2mgL–1NAA+20mgL–1kan上,待根系发达成为完整植株时,经炼苗移栽在花盆中遮荫保湿培养(以上培养基均含3%蔗糖,并用0.8%的琼脂固化,pH5.8。培养条件为25℃、光16h/暗8h)。农杆菌菌液浓度和侵染时间对转化的影响侵染时间农杆菌菌液浓度（OD600)接种外植体数再生绿芽转化率2min0.020.083445970100.165min0.050.080.12472576522125302.549.2008min0.050.08492483911.800.35实验平均转化率为2%。农杆菌的浓度和感染时间是影响遗传转化率的重要因素。试验证明,当农杆菌菌液浓度(OD600)在0.05~0.08时处理外植体5~10min,效果较好4转基因植株的PCR检测采用CTAB法[26]提取植物基因组DNA,上游引物为5′-AGCGAGACGTTCAACAATACGC-3′,下游引物为5′-GCAGAATACCCATCCAATTCCTT-3′,以非转基因油菜植物总DNA为阴性对照,以质粒DNA为阳性对照,采用20μL反应体系进行PCR扩增。反应程序为94℃4min,94℃30s、53℃30s、72℃45s,30个循环,72℃5min。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。抗性植株的PCR及Southern检测转基因植株的PCR检测结果M:DNAmarker;1~7:转基因植株DNA扩增片段;CK−:阴性对照;CK+:阳性对照