金华火烧副产品蛋白酶解物功能特性与抗氧化活性研究

金华火烧副产品蛋白酶解物功能特性与抗氧化活性研究

金华大火是中国著名的传统特产。它与云南宣威煎剂和江苏省如皋煎剂一起被称为中国的“三大煎剂”。金华火腿素以“色、香、味、形”四绝闻名中外,广泛应用于食品的加工和调味,深受消费者的青睐。目前,以切片真空包装形式销售的火腿产品在分割时会产生大量的骨、皮等副产品。据统计,仅浙江省每年的火腿副产品产量超过2000t。这些副产品一直未能得到充分利用,通常被作为废物处理,或作为饲料和低值的食品加工原辅料,造成了资源浪费及环境污染。采用酶工程技术制备蛋白酶解物,可为资源丰富、价格低廉的金华火腿副产品的增值利用提供有效途径。蛋白酶解物是各种动、植物蛋白原料经蛋白酶酶解之后得到的产物,主要含有氨基酸、肽等成分。由于具有较高的营养价值,良好的功能特性和生物活性,蛋白酶解物作为风味增强剂、功能活性成分以及营养强化剂,被广泛应用于食品、饲料、化工、医药等众多行业。有研究表明,蛋白质酶解后,可产生具有一定功能性质的肽段,这些多肽分子质量相对较小,且酶解解离过程中通常伴有重要结构的重排,导致一些原来包埋在蛋白质分子内部的疏水区暴露出来,从而使其口感特征、溶解性、持油性、乳化性等均发生显著的变化。抗氧化活性是蛋白酶解物最重要的一种生物学活性,已引起国内外许多研究人员的关注。一方面,食品工业上广泛使用人工化学合成的抗氧化剂(如BHA、BHT等)以避免食品组分氧化,这类抗氧化剂具有一定的毒副作用;另一方面,人们越来越关注食品的安全性问题,蛋白酶解物及其所含的天然抗氧化肽因具有较强的抗氧化活性和很高的安全性,在食品等领域展现出极好的应用前景。本文以金华火腿副产品为原料制备的蛋白酶解物作为研究对象,分析其乳化活性、乳化稳定性、起泡力等功能特性,并通过体外试验考察其自由基清除能力、还原力以及抑制脂质过氧化能力,为进一步利用火腿蛋白酶解物开发相关功能性食品添加剂提供理论依据。1材料和方法1.1风味蛋白酶金华火腿副产品蛋白酶解物的制备:以金华火腿副产品为原料,经整理、粉碎、去盐、脱脂等预处理后,采用中性蛋白酶和风味蛋白酶组合(质量比2∶1)进行酶解,加酶量3%,初始pH6.5,酶解温度40℃,酶解时间3h。酶解结束后灭酶、离心,将上清液冷冻干燥,最终获得淡黄色的粉状酶解物。DPPH(2,2-Diphenyl-1-picryhydrazyl),购于sigma公司;亚油酸,购于上海百灵威化学技术有限公司;其它试剂均为国产分析纯级。1.2测试方法1.2.1sds吸光度测定参照文献的方法,并作适当修改。24mL0.1%金华火腿副产品蛋白酶解物溶液用0.1mol/LHCl或0.1mol/LNaOH分别调pH至3.0、5.0、7.0、9.0,加入8mL大豆色拉油,用剪切乳化仪10000r/min搅打1min后立即于容器底部取样100μL,用0.1%SDS溶液稀释100倍,混匀后于波长500nm处测定吸光值,以SDS溶液作为空白。室温放置10min后再次取样测定其乳化稳定性(ESI)。乳化活性EAI(m2/g)=(2×2.303×A500×N)/(CφL×104)乳化稳定性ESI(min)=(A0×10)/(A0-A10)式中,C——样品质量浓度,g/mL;φ——乳化液中油相的比例,0.25;L——比色杯的光径,0.01m;N——稀释倍数;A0——初始乳化液的吸光值;A10——10min后的吸光值。1.2.2静置ph的测量酶解物起泡力(FA)与泡沫稳定性(FS)采用Shahidi等的方法测定,并稍作改动。100mL3%金华火腿副产品蛋白酶解物溶液用0.1mol/LHCl或0.1mol/LNaOH分别调pH至3.0、5.0、7.0、9.0,测量高速剪切仪10000r/min搅打3min后的泡沫及液体总体积,接着分别测量静置10、30、60min时的总体积。起泡力和泡沫稳定性的计算公式如下:式中,V0——搅打前液体的体积,mL;V——搅打后的总体积,mL。式中,V——搅打后的总体积,mL;Vt——静置不同时间后的总体积,mL。1.2.3邻苯三酚自氧化的抑制率的测定按文献的方法测定。取0.1mL不同浓度的酶解物溶液,分别加入2.8mL0.1mol/LTris-HCl缓冲溶液(pH8.2),空白管以蒸馏水代替,混匀后在25℃水浴中保温10min,加入0.1mL3mmol/L邻苯三酚溶液(25℃水浴预热),迅速混匀并开始计时,在波长325nm处测定吸光度,每隔30s读取1次,5min后结束,计算邻苯三酚的自氧化速率。邻苯三酚自氧化的抑制率计算公式:抑制率(%)=(V0-Vi)/V0×100式中,V0——空白组邻苯三酚的自氧化速率(ΔA/min);Vi——加入样品后邻苯三酚的自氧化速率(ΔA/min)。1.2.4对dpph的清除作用参照Liu等的方法并作稍微修改,具体方法是:配制0.2mmol/LDPPH无水乙醇溶液。取待测样0.2mL,加入0.1mol/LTris-HCl缓冲液(pH7.4)0.8mL,加入1mLDPPH溶液于具塞试管中,摇匀,室温下暗处放置30min后,以无水乙醇作参比,测定其吸光度Ai;同时测定0.2mmol/LDPPH溶液与等体积无水乙醇混合液的吸光度Ac,待测液与9倍体积0.1molLTris-HCl缓冲液混合液的吸光度Aj,计算清除率:清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%式中,Ac——未加待测样品时DPPH溶液的吸光度;Ai——加待测样品时DPPH溶液的吸光度;Aj——待测样品在波长517nm处的吸光度。1.2.5铁氰化钾溶液5.2工作溶液参考文献的方法并略作改动。将样品分别按不同浓度溶于1mL蒸馏水中,加入2.5mL0.2mol/LPBS(pH6.6)和2.5mL1%铁氰化钾溶液于试管中混匀。混合物在50℃水浴中反应20min后,迅速冷却并加入2.5mL10%TCA,混匀后以3000r/min离心10min。取1mL上清液,加入0.2mL0.1%三氯化铁溶液混匀,再加入1mL蒸馏水摇匀,以蒸馏水调零,在700nm处测定吸光度。吸光度越高,说明反应混合物的还原性越强。1.2.6硫氰酸铵氧化收率的测定采用亚油酸抗氧化体系,按文献的方法并稍加修改,具体方法是:将酶解物溶于5mL50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)中,加入5mL无水乙醇和65μL亚油酸,用蒸馏水补充至12.5mL,混匀后用硅橡胶塞密封,置于60℃恒温培养箱中保温,每24h测定吸光度。吸光度的测定方法:取0.1mL反应液,依次加入0.1mL75%乙醇溶液,0.1mL30%硫氰酸铵溶液和0.1mL硫酸亚铁溶液(含3.5%HC1),混匀5min后在波长500nm处测定吸光度。每天测定1次吸光度。以不添加酶解物的样液为空白对照。2结果与讨论2.1体系ph值对乳化性能的影响乳化性的衡量指标包括乳化活性指数和乳化稳定性指数。其中乳化活性指数的测定是依据蛋白乳化液的浊度和乳化微粒界面面积存在一定线性相关性,而乳化稳定性是与乳化颗粒直径及时间相关的性质,一般乳化液的粒径越小,乳化稳定性越好。蛋白质一旦被酶水解,其致密的空间结构便会发生变化,部分包埋在分子内部的疏水性基团得以暴露,疏水性增加,有利于与油滴的结合,提高了在界面的吸附,并形成内聚性膜。同时,疏水性残基与油相互作用,亲水性残基与水相互作用,促进了分子亲水、疏水性质的平衡,从而提高蛋白水解物的乳化性。不同pH条件下金华火腿副产品酶解物的乳化性能如图1所示。随着体系pH值的升高,EAI表现出上升趋势,而ESI先降低后上升。当pH9.0时,两个指标均达到最大值,说明此条件下酶解物的乳化性能最好。这与刁静静等关于骨蛋白水解物乳化性的研究结果一致。2.2蛋白分子活性蛋白质及其酶解物的良好起泡性在食品工业上起着非常重要的作用。起泡性质通常用起泡力和泡沫稳定性来评价。起泡力是指搅打后起泡的能力,而泡沫稳定性是指泡沫保持稳定的能力。蛋白分子在酸性或碱性条件下带净正或净负电荷,导致分子间静电斥力增加并削弱分子的疏水相互作用,分子柔性增大,有利于其更快地吸附至气-液界面,从而增强起泡能力;但是蛋白质-蛋白质分子间相互作用的减少,不利于界面上稳定的蛋白质膜的形成,因此起泡稳定性有所降低。从表1数据看,在酸性和碱性较强的条件下,金华火腿副产品蛋白酶解物的起泡力较高,起泡稳定性较好,尤其在pH9.0时,起泡性能最佳,而在中性条件下稍差。蛋白酶解物在等电点处的起泡能力最差,因此推断金华火腿副产品蛋白酶解物的等电点接近7.0。2.3抗疲劳2.3.1清除邻苯三酚自氧化能力自由基活性氧会破坏生物大分子(如蛋白质、酶和DNA等),引起DNA突变或断裂以及功能蛋白和膜结构的破坏。超氧阴离子及其衍生的自由基均具有细胞毒性,会导致DNA损伤及细胞膜损伤。研究表明,超氧阴离子自由基是生物体内所有氧自由基中的第一个自由基,可通过岐化反应和其它反应途径产生H2O2和羟自由基,是生物体系中自由基产生的根源。自由基的淬灭是抗氧化剂抑制氧化进程的一个基本机制,因此超氧阴离子清除能力可作为抗氧化活性测定的一个重要指标。在碱性条件下,邻苯三酚迅速发生自氧化,同时释放出超氧阴离子和有色中间产物,该有色中间产物在320nm处有强烈的吸光度。当有超氧阴离子清除剂存在时,能够抑制中间产物的生成,进而起到抑制邻苯三酚的自氧化作用。如图2所示,金华火腿副产品蛋白酶解物溶液能够抑制邻苯三酚的自氧化,具有一定的超氧阴离子清除能力,当质量浓度为7.5mg/mL时效果最佳。在试验过程中,随着溶液浓度的增大,超氧阴离子清除能力先逐步增强后呈下降,这可能是由于酶解物中不仅含有抗氧化活性成分,还存在一些促进邻苯三酚自氧化的成分,具体组分还需作进一步的分析。2.3.2不同浓度下聚氧酶解液对dpph自由基的清除能力DPPH是一个相对稳定的自由基,在甲醇溶液中于517nm处有最大吸光度值。当其从抗氧化剂处接收一个电子或者氢原子,自由基被清除,从而使吸光度下降。因此,DPPH通常被用作衡量各种抗氧化剂清除自由基能力的反应底物。本试验中,不同浓度火腿副产品酶解液均具有一定的DPPH自由基清除能力,测定结果见图3。随着酶解液浓度的增大,DPPH自由基清除能力呈上升趋势,但两者之间没有线性关系。当酶解液质量浓度为10mg/mL时,DPPH自由基清除率达32%。2.3.3还原三价铁离子化合物的还原能力是评价其抗氧化活性的另一个重要指标,一般情况下,该物质的还原能力与抗氧化能力呈正相关。通过测定还原能力,可以判定待测物是否为良好的电子供体。待测物提供的电子可使三价铁离子还原为二价铁离子,并使体系溶液的颜色发生改变。根据体系溶液在700nm处吸光值的变化,可以检测生成的二价铁离子浓度,其吸光值越大,表明待测物的还原能力越强。本研究结果显示:不同浓度的金华火腿副产品蛋白酶解物溶液的还原力测定值与DPPH自由基清除率呈相同的变化趋势,在最大质量浓度10mg/mL时,还原力为0.79。2.3.4火炬酶解物添加量对期进程中带氧化作用的影响研究表明,脂类的氧化是一个十分复杂的进程,包括自由基的形成、增多以及有氧存在条件下初级氧化产物脂过氧化物的产生等。亚油酸自氧化过程中会产生过氧化物,可将Fe2+氧化为Fe3+,而Fe3+与SCN-形成的络合物于波长500nm处有最大吸光度,因此吸光度越大,表明亚油酸的过氧化程度越高。由图5可见,当不添加火腿酶解物时,随着时间的增加,吸光值明显上升,说明亚油酸的自氧化作用较显著。与空白对照组(0mg/mL)相比,添加不同质量浓度(2.5~10mg/mL)的火腿酶解物的各组吸光度值均有所降低,揭示该酶解物在不同程度上抑制了亚油酸的自氧化,并且随着浓度的增加,对亚油酸自氧化的抑制效果增强。目前常用的体外抗氧化活性测定方法主要包括:通过测定特定环境下,样品对测试体系中脂类物质氧化抑制能力来评价被测物的抗氧化能力;通过对自由基的捕获能力来反映待测物抗氧化活性;测定还原能力及其螯合金属离子的能力。按照上述方法测定相关指标,其结果与其它蛋白酶解物的研究结果相类似,金华火腿副产品蛋白酶解物具有较高的体外抗氧化活性。此结果揭示金华火腿副产品蛋白酶解物中存在一定数量的抗氧化肽。这些抗氧化肽的分离、纯化及氨基酸序列分析有待于深入的研究。3乳化和起泡功能在体系pH为9.0时,金华火腿副产品蛋白酶解物的乳化活性和乳化稳定性均较好;体系pH为3.0、9.0时,酶