骨髓间充质干细胞输注对炎症性肠病的影响

骨髓间充质干细胞输注对炎症性肠病的影响

0间充质干细胞治疗炎症性肠病的优势炎症性肠病是一组非特异性肠炎，包括溃疡性胃炎和克罗恩病。炎症性肠病是消化系统常见疾病之一,多数患者病情呈长期反复发作,往往发展为终身致残性的慢性疾病,严重影响个人生活质量甚至危及患者生命,现有的临床治疗方法疗效并不令人满意,迫切需要探索新的有效的治疗手段。目前的研究表明,输注骨髓间充质干细胞有望成为临床治疗炎症性肠病最有前景的方法之一。已知炎症性肠病的炎症是一种癌前病变,随着病程的迁延,发生癌变的风险逐年增加。因此推测,输注骨髓间充质干细胞在治疗炎症性肠病的过程中,由于控制了炎症,可能进而减缓或抑制炎症性肠病炎症恶性转化的进程。然而,在乳腺癌等肿瘤的研究中显示间充质干细胞可能参与肿瘤间质形成、成血管作用及免疫抑制等而促进肿瘤进展。这样,就提出了一个疑问,间充质干细胞在治疗炎症性肠病的同时,究竟是抑制还是促进炎症性肠病的恶变?这将是决定骨髓间充质干细胞能否广泛应用于炎症性肠病治疗的关键。鉴于此,实验首先通过小鼠实验性结肠炎模型来证实间充质干细胞治疗的有效性,并进一步构建小鼠结肠炎相关肠癌模型,模拟人体炎症性肠病炎症到肿瘤的漫长转化过程,来探讨间充质干细胞在治疗炎症性肠病中的远期肿瘤学安全性。1材料和方法随机对照动物实验。实验于2013年3至12月在中山大学实验动物中心及中山大学胃肠病学研究所完成。动物实验动物SPF级健康雌性3周龄(n=20)及7周龄(n=40)Balb/c(H-2d)小鼠,购自中山大学实验动物中心,动物许可证号SCXK(粤)2004-0011,在(22±1)℃恒温房内饲养,12h光照和12h避光循环交替,自由进食和饮水。所有动物实验方案遵守中山大学实验动物伦理委员会的有关规定。方法抗小鼠免疫表型的制备取3周龄SPF级雌性Balb/c(H-2d)小鼠,参照文献获取骨髓细胞,用含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养液,置37℃、体积分数5%CO2条件下培养。培养48h后首次换液,去除大量悬浮生长的造血细胞,之后每三四天更换培养液1次,当细胞达到80%以上融合时进行传代。应用FITC标记的抗小鼠CD29,CD45,MHC-Ⅰ,MHC-Ⅱ及PE标记的抗小鼠CD34,CD44,以流式细胞仪鉴定间充质干细胞的免疫表型。参考文献进行成骨、成脂诱导分化实验以检测其分化潜能(分别使用茜素红S和油红O染色)。取第三、四代骨髓间充质干细胞用于后续实验。小鼠肠管组织病理学检测取7周龄SPF级雌性Balb/c(H-2d)小鼠12只,适应环境1周后,参考文献,给予4%葡聚糖硫酸钠自由饮用7d,然后随机等分为间充质干细胞组和PBS组。间充质干细胞组分别于实验第2,5,8天经尾静脉注射0.3mL含1×106间充质干细胞的PBS细胞悬液,对照组则经尾静脉注射PBS。实验期间每天定时对实验动物进行临床评估,包括体质量、大便性状(黏稠度)、便血指征(大便隐血或肉眼血便)以及饮食、饮水情况。实验第15天,颈椎脱臼处死动物,切取整段结肠,分别剪取治疗组和对照组小鼠结肠远端、中段及近端长度为1cm的肠管组织,40g/L甲醛固定过夜,常规石蜡包埋,4μm连续切片。苏木精-伊红染色,常规倒置显微镜检查,明确炎症反应及上皮损害程度分级,并参考文献进行组织炎症损伤严重度评分。具体评分标准为:①炎症细胞浸润程度(0:无明显炎症细胞,1:浸润黏膜固有层,2:浸润黏膜+黏膜下,3:透壁浸润)。②黏膜损伤(0:正常形态,1:轻-中度上皮缺损,2:较大范围上皮缺损,3:隐窝缺损,4:较大范围隐窝缺损),每张切片的组织评分为2项得分之和。小鼠肠道建议的cm-dii模型体外培养的间充质干细胞贴壁后,以PBS洗涤3次,加入2mg/LCM-DiI工作液,37℃孵育5min,再转至4℃孵育15min,吸除CM-DiI工作液,PBS轻柔洗涤3次,胰酶消化制备3.5×109L-1间充质干细胞单细胞悬液。同前制备小鼠实验性结肠炎模型,于实验第8天经尾静脉注射CM-DiI标记的间充质干细胞。实验第15天,处死动物,分别切取结肠远端、中段、近端及小肠长度为1cm的肠管,立即置入-80℃保存。冰冻切片,层厚5μm,以Ti-U倒置荧光显微镜观察(荧光激发波长553nm,发射波长570nm)。间充质干细胞输注后向炎症肠道的转化参考文献构建小鼠结肠炎癌变模型。取7周龄SPF级雌性Balb/c(H-2d)小鼠10只随机等分为间充质干细胞组和PBS组,适应环境1周后,于实验第1天腹腔注射偶氮氧甲烷10mg/kg,2%葡聚糖硫酸钠饮水1周后接正常饮水2周为一周期,总共进行3周期。间充质干细胞组分别于实验第1,2,3周末经尾静脉注射0.3mL含1×106间充质干细胞的PBS细胞悬液,对照组则经尾静脉注射PBS。实验结束后处死小鼠,分离结肠,观察小鼠肠道肿瘤形成情况。①葡聚糖硫酸钠结肠炎小鼠模型中间充质干细胞实验组及对照组结肠炎症病变的病理学改善情况及组织炎症损伤严重度评分。②葡聚糖硫酸钠结肠炎小鼠模型中间充质干细胞输注后向炎症肠道的归巢分布情况。③葡聚糖硫酸钠/偶氮氧甲烷结肠炎癌变小鼠模型中,间充质干细胞实验组及对照组结肠肿瘤的形成情况。结果以ue0af±s表示,用SPSS15.0统计软件包(美国SPSS公司)进行处理。两组数据间采用独立样本t检验,P<0.05为差异有显著性意义。2结果的结果2.1小鼠岩板中小鼠岩板的急性毒性模型实验选用40只小鼠,分别构建实验性结肠炎模型和小鼠结肠炎癌变模型,并进入分组实验,所有小鼠无意外死亡,均进入实验结果分析阶段。2.2流式细胞检测骨髓间充质干细胞经扩增传代3代以后,获得形态比较均一的梭形细胞,平行排列或旋涡样单层集落生长,也可见多角形和扁平状细胞。相差显微镜下细胞核浆比大,胞浆少,核大,核仁明显。应用流式细胞检测显示,骨髓间充质干细胞不表达CD34,CD45和MHCⅡ类分子,高表达CD29,CD44和MHCⅠ类分子。体外经成骨诱导培养两至三周后,大多数细胞发生形态变化,由原来的梭形变为多角形或不规则形,细胞呈结节状生长,并有钙盐沉积,茜素红S染色证实有骨钙结节形成(图1A);成脂诱导分化2周后,细胞内可见融合成团、被油红O染成红色的脂滴(图1B)。2.3间充质干细胞治疗小鼠结肠远端组织病理学检测尽管对照组结肠炎小鼠在停止饮用葡聚糖硫酸钠后症状趋向逐渐好转,但治疗组小鼠恢复更加明显,腹泻、便血明显好转,实验结束时体质量丧失、粪便黏稠度(不成形黏稠大便)、大便潜血较对照组均有减轻。镜下,间充质干细胞治疗组小鼠远端结肠黏膜结构基本完整,有小范围上皮缺损或隐窝缺损,黏膜层和黏膜下层较多炎症细胞浸润,可见毛细血管和小血管增生。而对照组小鼠远端结肠黏膜结构较紊乱,有较大范围上皮缺损或部分隐窝消失,见少量隐窝脓肿,黏膜及黏膜下层有大量炎性细胞浸润,包括中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和浆细胞(图2)。间充质干细胞治疗组小鼠结肠远端组织炎症损伤严重度评分低于对照组(P<0.05;图3)。2.4胞核无标记标记体外CM-DiI标记间充质干细胞,显示细胞膜和胞浆质膜被标上染料,胞核无标记,标记率在90%以上。组织标本冰冻切片可见有CM-DiI标记的间充质干细胞向结肠远端炎症病变处归巢定殖,且主要位于黏膜下层(图4),同一小鼠结肠近端及小肠组织内未见CM-DiI标记的细胞。2.5小鼠骨髓间充质干细胞输注前3周经尾静脉输注前3周经尾静脉系统建立Balb/c(H-2d)小鼠的炎症性肠病癌变模型,在建模周期的前3周经尾静脉输注同系小鼠骨髓间充质干细胞3次。建模结束后观察肠道肿瘤形成的情况,如图5,结果显示经间充质干细胞治疗的小鼠肠道肿瘤数量及肿瘤负荷(单只小鼠肿瘤的直径之和)明显少于对照组(P<0.05)。3间充质干细胞对炎症性肠病恶变的作用随着对炎症性肠病发病机制的不断阐明和认识的不断深入,目前普遍认为炎症性肠病的发生是遗传易感个体,在环境因素及肠道菌丛的参与下,启动肠道黏膜免疫及非免疫系统,在抗原的持续刺激和免疫调节紊乱持续存在的情况下,导致炎症级联的放大和局部炎症递质对组织的损伤。其中,黏膜免疫功能的失调是炎症性肠病发生并呈慢性持续状态的中心环节。因此,以炎症/免疫调节为主的生物治疗将是炎症性肠病治疗的重要方向。骨髓间充质干细胞具有低免疫原性、免疫负性调节/抗炎、修复受损组织等多种特性,同时又具有细胞来源广泛,易于分离、体外培养和扩增等特点,使其在炎症性肠病的治疗方面显示出了诱人的临床应用前景。Forbes等开展的一项开放、多中心的临床试验对同种异体间充质干细胞治疗难治型克罗恩病(对infliximab或adalimumab难治性,克罗恩病疾病活动指数>250)的有效性进行了研究,结果显示,完成治疗的15例患者中,在治疗第42天,克罗恩病疾病活动指数评分平均由370降至203,其中12例有临床反应,有8例临床缓解,7例患者内镜下黏膜损伤得到改善。实验在小鼠葡聚糖硫酸钠结肠炎模型上,证实经外周静脉输注骨髓间充质干细胞能明显改善葡聚糖硫酸钠诱导的急性结肠炎小鼠的症状及肠道组织炎症。已有研究表明,间充质干细胞可向炎症组织归巢而发挥作用。作者采用荧光示踪染料CM-DiI标记体外培养的间充质干细胞,经尾静脉输入葡聚糖硫酸钠结肠炎小鼠体内,冰冻病理结果显示标记的间充质干细胞存在于结肠炎症病变组织,主要位于黏膜下层,而结肠近端及小肠未见有标记间充质干细胞的归巢,提示间充质干细胞能被招募迁移到肠道炎症病变部位。炎症性肠病炎症是一种癌前病变,可发生恶性转化,约2.7%的炎症性肠病患者在病程30年内发生癌变,约一半的癌变患者最终因罹患结直肠癌而死亡。炎症本身在炎症性肠病的癌变发生发展进程中起着决定性作用,动物及人体研究均提示抗炎治疗能降低炎症性肠病癌变的风险[18,19,20,21,22,23,24,25]。那么,似乎有理由推测,输注骨髓间充质干细胞,不仅仅控制炎症性肠病炎症,也可能抑制炎症性肠病恶性转化的进程。然而,目前在乳腺癌等肿瘤的研究中却显示间充质干细胞可能会通过免疫抑制、向肿瘤间质成分分化、或参与肿瘤微血管的构建,形成一个利于肿瘤生长的微环境;但这些证据是直接在肿瘤模型上给予间充质干细胞后进行实验而得出的,并不能反映在肿瘤形成的漫长转化进程中,给予间充质干细胞对肿瘤形成所起的作用。人类炎症性肠病的恶变是一个漫长的演变过程,输注骨髓间充质干细胞对炎症性肠病恶性转化的影响很难直接在人体身上进行研究,势必需要良好的动物模型来模拟人体内炎症性肠病炎症到癌变的转化过程。应用葡聚糖硫酸钠联合偶氮氧甲烷构建的小鼠结肠炎相关肠癌模型,周期较短、方法简便、成瘤率高,能在病理及分子机制方面较好地模拟人类炎症性肠病炎症向癌变转化过程的情况。为探讨输注间充质干细胞对炎症性肠病炎症向肿瘤转化的影响,应在结肠炎诱导之后、肿瘤未发生之前给予治疗剂量的间充质干细胞,而不是在形成肿瘤后给予,否则不能反映间充质干细胞对炎症性肠病炎症恶性转化的作用。作者所在课题组预实验,已从大体及组织病理学角度证实在第2个循环葡聚糖硫酸钠喂养期间(第4周),动物模型无肠道肿瘤形成的证据,由此确保实验中输注间充质干细胞是在模型发生恶变之前。实验发现,在炎症阶段输注间充质干细胞能明显抑制炎症性肠病小鼠肠道肿瘤的形成。实验结果提示间充质干细胞在治疗炎症性肠病的过程中,不会促进/加速炎症性肠病的癌变进程。间充质干细胞抑制炎症性肠病的癌变,可能通过控制炎症反应从而达到阻断炎症向肿瘤的演变,也可能通过直接的免疫调节或其他通路直接阻断炎症的恶性转化过程,其具体机制如何,还有待更深入的研究来阐明。综上所述,实验通过动物模型验证了输注骨髓间充质干细胞对炎症性肠病结肠炎治疗的有效性,并首次证实间充质干细胞能抑制而非促进炎症性肠病的恶性转化,为间充质干细胞治疗炎症性肠病的生物安全性及合理应用提供了客观的理论依据。所有作者共同参与实验的设计、实施及评估。何小文、陈泽贤对本文有同等贡献。文章及内容不涉及相关利益冲突。实验过程中对动物的处置符合中山大学实验动物伦理委员会的有关规定及2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。炎症性肠病-是一组多因素导致的肠道慢性非可控性炎症,包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。目前普遍认为炎症性肠病的发生是遗传易感个体,在环境因素及肠道菌丛的参与下,启动肠道黏