文件题目重症监护病房mrsa耐药性及病人分离株与环境中

目的：了解重症监护耐甲氧西林金葡萄球菌（MRSA）的耐药性特点，探讨监护分离株与环境中分离的MRSA的同源性，为临床治疗和预防提供理论依据。方法：对大学中南医院重症监护患者分离的金葡萄球菌和监护病菌科间重复序列为引物的聚合酶链反应(ERIC-PCR)分型技术进行同源性分析。结率为100%，环丙沙星、苯唑西林、红霉素、克林霉素、左氧氟沙星、庆大霉素耐药93.3％86.67。％93.3％80％73.3％80％妥布霉素耐药率为复方新诺明和氯65MRSANCUICU0%，对青霉素、头孢西丁、环丙沙星、左氧氟沙星耐药率为100%，对苯唑西林、红霉素、复方新诺明、庆大霉素、克林霉素耐药率为80%、80%、60%、40%。ERIC-PCR characteristics methicillin-resistantStaphylococcusaureus(MRSA)isolatedfromcareunitaswellasthewardenvironmentwhetherthereishomology,toprovideatheoreticalbasisforclinicaltreatmentandprevention.Methods:UseK-Bdiscdiffusionmethodtoyzethedrug ofWuhanUniversityZhongnanHospitalintensivecareunitpatientsandthe environment；and consensus-PCR(ERIC-PCR)todogenotyandhomologyysis.Results:15strainsofMRSAwereisolatedfrom25strainsofstaphylococcusfromICUandNCUclinicalpatients.15strainsofMRSAwereallsusceptibleto linezolid,teiconin,andtopenicillinandcefoxitin.Theratesofciprofloxacin,oxacillin,erythromycin,clindamycin,levofloxacin,gentamicin,tobramycin,trimethoprim,sulphame-thoxazole,chloramphenicolwere88.67%、88.67%、88.67%、80%、76.33%、70.67%、57.33%、26.67%和11.33%。,respectively.5strainsofMRSAwereisolatedfrom40strainsICUandNCUenvironmentspecimens.AndwerefromNCUdesktop,ICUdoctor’shand,twoairsamplesfromICUandICUsheets.5strainsofMRSAwereall levofloxacin.Theratesofoxacillin,erythromycin,trimethoprimandsulphame-thoxazole,gentamicinandclindamycinwere80%,80%,60%,40%,40%.ResultsofelectrophoresisafterERIC-PCRshowthatthebiggestmoleculeswasabout1050bp,andthesmallestmolecularwasabout100bp.Mostofthemhad1to3differentornoband.Conclusion:TheMRSAisolatedfromICUandNCUpatientsofzhongnanhospitalweremultiresistant.ClinicianshoulduseICUandNCUenvironmentwerealsomultiresistant.Andhadcertainhomologywasnotbig.:MRSA;ysisofdrug-resistantERIC; ;症监护（ICU）是医院的高危科室，金葡萄球菌是ICU常见致病菌，而明空气、工勤人员或医护人员手可以接触MRSA。国内外均有ICU环境分离出MRSA，且与临床分离标本有高度同源性，说明他们可能来自同一菌株的播散。目前MRSA的主要检测方法有表型检测法和法。金葡萄球菌的分型鉴定有很多种方法。学分型、凝固酶分型、毒素分型、噬菌体分型、耐药谱分型列的分子生物学分型方法。其中以肠杆菌科间重复序列为引物的聚合酶链反应(enterbacterialrepetitiveintergenicconsensus-PCR，ERIC-PCR)分型技术是以肠杆菌科间重复序列为引物进行PCR，能扩增出多态性的图谱。根据电泳图则认为2个菌株同源性差异很大。本实验主要通过 大学中南医院重症监患者的标本与环境的标本进行耐甲氧西林金片葡萄球菌的耐药检确治疗该菌引起的医院和防止其播散有重要意义。吸机以及空气5份。试剂和仪器：培养皿：血平板由广州迪景微生物科技提供，MH琼脂Taq聚合酶和dNTPs由Fermantas公司提供；marker由HBI公司提供；PCR微型紫外投射仪均由医学仪器提供；POWERPAC3000型电泳仪由美BIO-RAD公司提供。细菌的分离和培养按《临床检验操作规程》进行，细菌鉴定采用手工法。将触酶试验阳性，继续对其做血浆凝固酶实验。血浆凝固酶阳性则初步确定为金葡萄球菌，血浆凝固酶为凝固酶 采用K-B纸片扩散法。根据临床标准CLSI2010版推荐的K-B法及结果判定标准对分离到的金葡萄球菌进行药敏试验。具体操作为：将分离纯化K-B法筛选耐甲氧西林金葡萄球菌（MRSA）：头孢西丁（FOX，30ug）纸片直径≤21mm的金葡萄球菌判断为MRSA。体由浑浊变成清亮透明，团状物，可适当延长时间，直至清亮。加入等体积饱和酚，上下颠倒混合，混匀时操作不要剧烈，使其完全后12000rmp10min至完全。移取上层液，不要吸入两相界面的蛋白。(8)加入等体积氯仿，轻轻混合匀后，12000rpm离心5min。1/1037°C约3～5分钟，使刚刚干燥即可，否则很难溶解。2．1ERIC-PCR（试 用无菌 引物 引物 ∞中，溶解煮沸三次后加入1µLGoldenView，待冷却到60℃左右时准备倒胶。buffer混匀后加入样品孔中，以150bpMark作分子量对照。MRSA100%，环丙沙星、苯唑西林、红霉素、布霉素耐药率为复方新诺明和氯霉素耐药率相对较低，分别为26.67%和6.67%。15耐药率（R头孢西丁复方新诺明4青霉素1左氧氟沙星庆大霉素环丙沙星万古霉素00苯唑西林利奈唑胺00霉素00妥布霉素40ICU对氯霉素、万古霉素、利奈唑胺、、妥布霉素敏感，耐药率为0%，MRSA菌株对青霉素、头孢西丁、环丙沙星、左氧氟沙星耐药率为100%，苯唑西林和红霉素NCUMRSA3.2。头孢西丁5耐药率复方新诺明3青霉素5氯霉素00左氧氟沙星5庆大霉素2环丙沙星5万古霉素00苯唑西林4利奈唑胺00霉素2400妥布霉素00头孢西丁复方新诺明青霉素氯霉素0左氧氟沙星庆大霉素环丙沙星万古霉素00苯唑西林利奈唑胺00霉素00妥布霉素0者标本分离出的金葡萄球菌以及质控菌株采用ERIC-PCR方法做分析。电泳结果显示最大的分子约为1050bp，最小的分子约为100bp。电泳结果见图：图3.1ERIC-PCRFig.3.1TheelectrophoresisresultsofEIRC-图3.2ERIC-PCRFig.3.2TheelectrophoresisresultsofEIRC-或NCU临床分离株。耐甲氧西林金葡萄球菌（MRSA）引起的医院，MRSA耐药性是一个备受关注的问题，许多国家MRSA的检出率仍在不断增长【2】，MRSA已成为医院的重要病原菌之一[3-4]。MRSAICU内发生高患病率及高率的重要病因，欧洲1992ICUMRSA57MRSAICU的最后一道防线，但近几年又发现了对万古霉素耐药的MRSA，这给临床治疗带来了很大全敏感，耐药率为0%，对青霉素、头孢西丁、环丙沙星、左氧氟沙星、苯唑西林、红霉素呈高度耐药，耐药率大于80%，对复方新诺明、庆大霉素、霉素产生了较重耐药MRSA，为控制医院，应加强环境的微生物，定期对医务人员的手、物体表面、空气等进行细菌学，加强和医务人员的管理，加强的执行，及时采取预制措施。0100%，环丙沙星、苯唑西林、红霉素、明ICU及NCU的MRSA多重耐药现象比较严重临床医生应正确合理使用抗各不相同的条带或没有明显清晰的条带。可能是由于提取的PCR标本同源性不大insertionsequence-likeelementrelatedtoIS26fromProteus研究[J].医院学，2006,16(10):1086-1088.VentJL,BihariDJ,SuterPM,eta1．TheprevalenceofialinfectioninintensivecareunitsinEurope．JAMA，1995，274(8)：639-644.inPharmacol,2003;3(5):474-9.姚国平，潘虹霞，蔡波.ICU耐甲氧西林的金葡萄球菌(MRSA)的分OjeniyiB．Polyagglulinablepseudomonasacruginosafromcysticfibrosispatients：asurvey．APMIS，1994，46(suppl)：1-44.华南预防医学，2004，30(5):1- MRSA是引起医院的主要病原菌，在第一个耐青霉素酶的β-内酰胺类抗生甲氧西林用于临床不久，1961年英国了世界上第1株MRSA[1]，由于大量抗生MRSA 的检出率仍在增长，MRSA已成为医院的重要病原菌之一。据疾病控和预防(CDC)统计，世界每年约有100000人MRSA。国各地MRSA生率波动在20％~80％。且MRSA大多表现为多重耐药，不仅对β治疗MRSA的最后一道防线，但近几年又发现了对万古霉素耐药的MRSA，这临床治疗MRSA带来了很大。MRSA引起的医院目前已成为全球备受重视得的耐药、表达调控有关的耐药和主动外排系统等。1,1MRSAMRSA的固有耐药性是由介导产生。MRSA的上携带有一个甲氧西林生78KDa的特异性低亲和力的青霉素结合蛋白PBP2a。金葡萄球菌固有的PBPsPBPs：PBP1、PBP2、PBP3和PBP4。PBP1、2、3均为转肽酶，为细菌所必需。PBP4PBPsβ-内酰胺抗生素都有MICPBPs壁的合成，从而使细菌得以，表现出对抗生素的耐药。固酶的葡萄球菌如松鼠葡萄球菌携带的mecA。目前，关于MRSA的MRSAmecATn554因为有资料表明mecA能反复地水平给八种以上金葡菌家系，在抗生素的选择下有的耐药克隆被。第二种假说通过多位点酶电泳分型检测mecA认频繁地传给MSSA。vanA要作用，它可以通过质粒自由转移。Noble等经体外实验证实肠球菌属的耐药vanA能通过结合转移进入金葡萄球菌，导致金葡萄球菌对万古霉素高度Mlynarczyk等研究也发现：肠球菌属通过结合转移可使受体菌（有肠球菌万古霉素耐药-vanA，而且该患者有耐万古霉素肠球菌（VRE）感染[12-13。MRSAPBP2a，但对甲氧西林的敏感性相差很大，细菌上有表达甲氧西林耐药的必需因子，即fem（factoressentialformethicillin）或称为aux因子（auxiliaryfactors）。目前已被识别femfemA、femB、femC、femD、femE、femF。femAfemB的产生不受影响。femC的失活也可降低细菌对甲氧西林的耐平，但对异质性耐药性的表达没有影响。femD的失活虽可增高细菌对甲氧西林的敏感性但高水平的同质性耐药的菌株。Agr(accessorygeneregulator)位点和sar(staphylococcal改变但PBP1PBP3的数量减少，这可能与细菌耐药性表达有关。的耐药性时同时发现的。学者们对主动外排系统进行了大量的研究，证实了主动诱导时，系统的被激活，表达增加，外排药物的功能大大增强，因此表现出耐药性。MRSA对多种药物存在耐药性，主动外排系统在其中发挥了作用。存在于金3QacANorASmrNoguchi等认为是MRSA中很重要的一种。多药泵出蛋白都属于质子驱动蛋白(PMF)，即不是依赖于ATPH一个反转过程：即H从胞外到胞内，而胞内有害物质如、抗菌药物从胞内流胞外。KristiansenMRSA1.3表达的调mecA转录调控系统主要有两种即mecR1-mecl系统和blaR1-blal系统。 mecRl-meclBlaR1(一种跨膜蛋白)接触到内酰胺后即从结合点脱落，从而使mecA转录，最终产生PBP2a。30℃~35℃，PH7.0~7.2，4%PBP2a的产量最高。因此，对于表型敏感但上携带mecA的细菌应视为耐甲氧西林抗生素选择下原有产生PBPs的发生突变，导致这些PBPs与β-内酰胺抗生西林在内的耐酶青霉素及头孢菌素，使抗生素失活而表现为耐药。但这些引起的临床标准（CLSI）推荐MRSA的表型检测方法包括药片法、切相关，使得这些药敏试验存在实验条件的问题。CLSI对实验的条件、质96.7%而敏感性只有61.3%（NCCLS）列为参考方法。Sakoulas.G性均为99%，特异性分别为98.1%和100%。但也有研究表异质性的菌株能降临床应用较少。E带的交点MIC值既可判断结果。具有简便、可靠的特点，其缺点是价格昂贵MRSA球菌生长，即使只有一个菌落，也判断为MRSA。无菌者则为甲氧西林敏感的金苯唑西林琼脂稀释法是NCCLS/CLSI推荐检测MRS的经典方 在苯唑西林测无效，NCCLS已不再推荐用该试验检测这些细菌。MH4mm，0．5特异性为96.8％。为目前临床微生物常规筛检MRSA方法之一。但由于新的变异株不断出现，使MRSA头孢西丁纸片扩散法是NCCLS/CLSI2004MRSA测结果。常用的灵敏度能够达到可接受标准(96%)的自动检测系统有VITEKGPS2SAATBStaphBaxterMicroscan个MIC值，因此其结果存在一定的偏差。98.5100%mecA的灵敏度和特异性，为临床提供了一种快速有效检测MRSA的方法，尤其在没微量临床标本检测时易出现误差。应注意因PBP2a低表达而产生的假。4PCR(polymerasechainreactionmecA表达受多种因素影响，造成MRSA耐药表型变异，但mecA不受任PCR法，指利用耐热 在体外迅速将模板扩增数百万倍的一种操作技术。mecA高度保守，根据其MRSAmecAS，应同时检测MRSA，MRSA、金CNS，PCRMRSA是目前医院的重要病原体之一，越来越引起医学界的重视。虽然受菌各医院的检出有一些差异，由于MRSA对多种抗菌药物耐药，造成临床治疗，已药的检测及耐药机制的研究是全球界倾力关注的焦点问题，为此临床准确、快速地对该株进行筛选和确认，是控制MRSA的关键。依据药敏试验结检测，想要对MRSA分型还得通过。因此检验科室应提高细菌培养和技术水平，特别是应缩短报告时间，为MRSA提供准确的诊断依据。MP“Celbenin-BergerBachiB,RohrerS.FactorsinfluencingmethicillininStaphylococci[J].Aricrobiol,2002;178(3):165-71.insertionsequence-likeelementrelatedtoIS26fromProteus研究[J].医院学，2006,16(10):1086-1088.275．[7]EnrightMC.TheevolutionofaresistantpathogenthecaseofMRSA[J].CurrOpinPharmacol,2003;3(5):474-9.CoutoI,SanchesIS,Sa-LeaoR,etal.MolecularcharacterizationofStaphylococcussciristrainsisolatedfromhumans.JClinMicrobiol,WieldersCL,FluitAC,BrisseS,etal.mecAGeneIsWidelyDisseminatedinstaphylococcusaureusPopulation.J.Clin.Microbiol,2002,40(11):3970-ClarkNC,WeigelLM,PaJB,etal.ComparisonofTn1546like 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