益活清胰汤对大鼠重症急性胰腺炎合并胰性脑病海马cai区bfgf的影响

益活清胰汤对大鼠重症急性胰腺炎合并胰性脑病海马cai区bfgf的影响

龚氏脑病（pe）是指急性胰腺（ap）引起的大量炎症介质、活性蛋白水解酶和磷脂酶a进入脑，导致脑组织和血管损伤以及中枢神经功能障碍的综合症状。发病率为35%，死亡率为66.9%。由于sap引起的低氧血症、低钙血症、脑缺血和水电解质平衡的紊乱，胰酶消失。磷脂酶a2（血丙基硫酸钠，pla2）激活血液，通过脑实质膜障激活血液循环，导致中风、软化和游离骨髓。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是一种重要的多肽生长因子,广泛分布于多种组织和器官,尤其是在神经组织中含量最丰富。在正常的情况下,脑内仅有少量bFGF表达,当脑受到各种损害时即可诱导bFGF表达明显增高。我们观察了SAP脑损害时TNF-a、IL-6、ALP2及海马CAI区bFGF的表达变化及益活清胰汤的干预作用,旨在进一步探讨胰性脑病的发病机制。1材料和方法1.1药物、试剂和仪器雄性SD大鼠45只,质量250~280g,由华西医科大学动物实验中心提供(合格证号:川实动管质07号),5%牛磺胆酸钠(美国Sigma公司出品),4%多聚甲醛由华西医科大学法医病理教研室配制,bFGF免疫组化试剂盒(BOSTER(博士德)生物公司提供),图象分析仪(Moticimageadiance3.0德国),益活清胰汤(大黄50g、芒硝50g、黄芩15g、白芍15g、麦冬15g、木香9g、柴胡12g、槟榔12g、苦楝皮10g、使君子12g、川芎12g、丹参15g、黄芪15g、人参10g,其中大黄、芒硝后下),以水煎法制成100%药液,含生药1g/mL,由成都中医药大学药理实验中心制备。1.2动物胰腺术后培养应用随机数字表,将实验大鼠随机分为3组,每组15只,A组(假手术组)、B组(造模组)、C组(益活清胰汤组),实验前禁食12h,自由饮水。3%戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉(剂量35mg/kg体重),常规消毒,铺巾,沿腹白线切开入腹,B、C两组经胰胆管逆行加压注入5%牛磺胆酸钠溶液(剂量1.5mL/kg体重)约10min左右胰腺出现肿胀及点状出血坏死,A组动物仅翻动胰腺,C组术前两天及术后益活清胰汤灌胃3次/d,每次1.5mL/100g体重。A组、C组用等量生理盐水灌胃,3次/d。3组分别于术后6h、12h、24h后各处死动物5只。1.3小鼠海马cai区表达bfgf蛋白的检测大鼠经戊巴比妥钠麻醉,开胸暴露心脏,直视下将穿刺针头经左心室刺入升主动脉。先用生理盐水100mL灌注,剪开右心耳放血,制备血浆,常规检测血清淀粉酶(AMY)、血清脂肪酶(LIP)、磷脂酶A2(PLA2)及IL-6、TNF-a,再灌注含4%多聚甲醛的缓冲液约250mL(以肝脏颜色变白为准),取胰腺组织于4%多聚甲醛固定,常规脱水包埋,切片HE染色后光镜观察,随后开颅取左脑视交叉后3mm处至小脑前部分组织,至组织下沉后石蜡包埋,冠状连续切片,厚5μm。加3%H2O2(室温30min,除内源性酰氨酶),正常小羊血清封闭(室温30min),加入I抗(兔抗FGF-2抗体)1∶250,4℃过夜,加入Ⅱ抗(羊抗兔IgG/生物素化),37℃下30min,然后加入Ⅲ抗(链酶蛋白/HRP),37℃下30min,DAB显色,苏木素复染,胞浆染成黑色为阳性,或细胞核呈黑色,每只大鼠选1张切片,每张切片任取5个视野,用图象分析仪测定海马CAI区单位面bFGF细胞灰度,灰度值是反映透光密度的定量指标,灰度值越高表示bFGF蛋白表达量越低;而灰度值越低,则表示bFGF蛋白表达量越多。1.4统计处理所有值均采用x¯±sx¯±s表示,组间比较采用t检验,统计分析使用美国SPSS软件包,P<0.05为显著性差异。2结果2.1两组用药前后各时段比较大鼠术后6h出现AMY、LIP、PLA2水平的升高,治疗组用药后各时段较对照组明显下降,与对照组比较P<0.01,与正常组相比,P<0.05。与A组比较,aP<0.05;与B组比较,bP<0.012.2血清tnf-a、il-6水平大鼠术后6h出现TNF-a、IL-6水平的升高,治疗组用药后的血清TNF-a、IL-6则明显降低,各时段与对照组相比P<0.01,24h后逐渐回落,与正常组相比,P<0.05。与A组比较,aP<0.05;与B组比较,bP<0.012.3鼠胰腺组织病理学检测图1(A组)胰腺未见明显病理改变;图2(B组)大鼠胰腺出现血坏死,多为凝固样坏死。腺泡呈孤岛样分布;图3(C组)病理改变明显减轻,胰腺细胞轻度变性水肿,间质血管扩张,充血小叶间隔增宽,少量脂肪坏死。2.4各组bfgf表达比较与A组比较,aP<0.05;与B组比较,bP<0.01表3示,各组均有bFGF表达,C组表达最强,A组和B组最弱,C组与A组比较P<0.05,C组与B组比较P<0.01,说明生理状态下脑组织bFGF表达水平较低,术后合成增加。3益活清胰汤治疗急性ap的作用机理AP并发多器官衰竭和较高的死亡率为临床所棘手,脑组织是主要受损器官,重症急性胰腺炎(SAP)的3大常见器官损害中,心、肺损害目前能够做到早期诊断及正确治疗,而脑损害尚无有效方法,严重影响了SAP治愈率。目前对其进行了大量的实验和临床研究,但仍有许多问题有待解决,胰性脑病(PE)为并发于急性AP的严重并发症,临床表现有多种精神神经症状。神经病理改变主要是急性局限性脑水肿、脑软化、血管周围脱髓鞘及多发性小出血,少数病例发展迅速,严重,很快死亡。PE的病因目前主要认为是急性AP导致胰酶逸出,磷脂酶A2(PLA2)活化入血,可使胆汁中的卵磷脂分解为具有细胞毒性的溶血卵磷脂,引起血脑屏障破坏,并溶解破坏中枢神经髓鞘,使脑神经纤维发生脱髓鞘改变并能破坏乙酰胆碱囊泡抑制乙酰胆碱的释放,影响神经—肌肉信号传导。近年来研究发现大鼠急性AP血脑屏障通透性增高与TNF-a、IL-6的血中含量升高密切相关,因而认为炎性细胞因子与PE的发病可能有着重要联系,胰性脑病的发生为全身组织器官损伤的产生和加重奠定了基础。因此,保护脑组织功能,阻断其损害至为重要。防止和治疗胰酶逸出和继之发生的(PLA2)的激活,降低血浆TNF-a、IL-6的水平是中医、中药治疗PE的主要作用机理。从这一角度挖掘中药也是一个必不可少的手段,对活血化瘀中药在急性AP中的主要机理的研究已取得了共识,其主要作用有:①扩张血管改善胰腺微循环障碍;②抑制胰腺外分泌、降低胰管内压;③降低毛细血管通透性,减轻和清除炎症。活血化瘀药在治疗急性AP方面,与通里攻下药具有协同作用。本实验发现在SAP发生后24h即出现大鼠脑组织病理损害,同时伴有TNF-a、IL-6、AMY、LIP、PLA2的明显升高,与上述文献研究相符。我们在实验中检测大鼠血浆TNF-a、IL-6、PLA2的水平,发现TNF-a、IL-6、PLA2与大鼠脑损害密切相关,提示TNF-a、IL-6及PLA2可能是介导胰性脑病的重要因素,连续监测TNF-a、IL-6、PLA2可能有预示胰性脑病发生的作用,有利于临床尽早发现问题,降低胰性脑病的发生率。本实验应用益活清胰汤后,大鼠胰腺、脑组织的病理改变明显减轻,血浆AMY、LIP、PLA2、TNF-a、IL-6水平下降,与对照组相比有显著性差异,说明益活清胰汤能改善微循环,稳定溶酶体膜,减少因微循环障碍而导致的胰酶激活,阻止TNF-a、IL-6的产生,对治疗SAP合并PE有一定的价值。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是一种重要的多肽生长因子,也是FGF家族中主要成员之一,广泛分布于多种组织和器官,尤其是在神经组织中含量最丰富,bFGF通过旁分泌和自分泌机制发挥许多重要生理特性。bFGF的主要功能包括:①直接营养神经元、神经胶质细胞和血管内皮细胞,促进各种胶质细胞和神经元细胞的繁殖和分化,促进中枢神经元存活,维持中枢神经系统的正常功能;②调节血管舒缩状态及局部脑流量;③稳定Ca2+稳态,保护神经元,bFGF与受体特异性结合后,激活酪氨酸激酶,影响各氨酸受体蛋白、Ca2+结合蛋白等的表达以稳定Ca2+稳态;抗氧化,兴奋性氨基酸及自由基等的损伤而保护神经元;④阻止DND和促进新的神经元芽生长及突触形成,还能保护神经元对抗多种损伤。在正常情况下,脑内仅有少量bFGF表达,当脑受到各种损害时即可诱导bFGF表达明显增高,脑组织缺血性损伤时,bFGF可以从受损的细胞中释放出来,作用于神经元、胶质细胞和内皮细胞,刺激邻近细胞合成和分泌bFGF,并增强靶细胞bFGF免疫活性。bFGF受体的表达也受到向上调节。缺血组织中兴奋性氨基酸。自由基、NO、Ca2+等化学信号的释放以及自缺血灶向周围组织扩散的去极化信号均可能进一步刺激bFGFmRNA的表达。bFGF具有抗兴奋性氨基酸及NO的神经毒性、阻止细胞内钙离子超载、扩张血管、保护神经元及抗缺血性脑损伤的作用,应用