固相萃取-高效液相色谱法测定饲料中磺胺类药物

固相萃取-高效液相色谱法测定饲料中磺胺类药物

磺胺类药物（sa）是指以对氨基苯甲酸的结构为基础的药物，主要包括磺酰胺、磺间甲氧胺、磺酰胺、甲基丙烯酸酯、磺酰胺和甲基丙烯酸酯。广泛应用于水产养殖中。动物组织、血液、蛋、奶、蜂蜜中磺胺类药物的检测方法已见诸报道,主要有薄层色谱法、酶联免疫法、高效液相色谱法或高效液相色谱柱前或柱后衍生荧光检测法。而饲料中多种磺胺类药物的检测方法还未见报道,本文研究建立了SPE-HPLC-UV测定饲料中磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉5种磺胺类药物的方法,并将该方法用于不同饲料基质中磺胺类药物的测定,结果令人满意。1材料和方法1.1水质、速度和波长5μm,250mm×4.6mm)。选用乙腈和水作为流动相,乙腈和水体积比例为25∶75,流动相的流速为1.0mL/min;WATERS474二极管阵列检测器,波长为270nm;WATERS717plus自动进样器,进样量为20μL。1.2直接使用的药物乙腈和甲醇为色谱纯(Fisher公司);冰乙酸为优级纯(国产);其他试剂为分析纯,国产,未进一步处理直接使用。磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉标准品(Sigma公司,纯度>99%);碱性氧化铝SPE小柱:SpeedSPECartridgesAluminaBasicALB(ABI公司),规格为1000mg/12mL。1.3乙腈溶液乙醇法分别配制5种磺胺的标准贮备液,浓度为1mg/mL,乙腈溶解(磺胺喹恶啉用甲醇溶解)。-20℃冰箱保存1个月。标准工作液现用现配,用流动相定容。1.4样品前处理1.4.1饲料中乙腈的提取称取配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料样品2g,置于具塞锥形瓶中,加入50mL的乙腈于振荡器振荡提取30min,过滤,滤液备用。1.4.2预混合饲料自然流速法准确吸取试液(2.4.1):配合饲料10~20mL;浓缩饲料、添加剂预混合饲料2mL,移入用10mL乙腈淋洗过的碱性氧化铝小柱中,令其自然流速流出。待试液全部流出后吹干,用2次2mL流动相洗脱,收集洗脱液,并过0.45μm的滤膜,滤液上机测定。2结果与讨论2.1冰乙酸、乙腈、水和乙酸体积比对色谱图的影响考察了乙腈+水+冰乙酸流动相体系,结果如图1所示。通过色谱图可知,在乙腈、水和冰乙酸体积比为75∶25∶3时最为适宜。在此条件下,5种磺胺类药物能够达到基线分离。另外,金霉素、青霉素等药物对其无干扰。2.2线性关系与相对标准偏差在优化条件下,磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉等5种磺胺类药物在0.2~200μg/mL浓度范围内,浓度与响应强度具有良好的线性关系,线性相关系数高于0.999,相对标准偏差(RSD)小于5%。结果见表1。2.3样品的预处理2.3.1样品测定条件的确定饲料组成极为复杂,对磺胺类药物的提取和测定干扰较大。在本研究中,考察了甲醇、70%酸性甲醇、乙腈和95%乙腈水4种提取剂的提取效果及对测定的影响。由图2可知以甲醇和70%的酸性甲醇为提取剂时,色谱图基线不平,可能影响样品的测定。而95%乙腈水对碱性氧化铝小柱具有穿透作用,使得目标分析物流失。因此,选择乙腈作为提取剂。2.3.2配合饲料的制备考察了氧化铝小柱的最大饱和容量,将标准溶液10μg/mL分别上柱2、5、10、20、30mL,结果如表2所示。由表中结果可知,碱性氧化铝小柱对磺胺类药物的承载量小于200μg。而磺胺类药物在配合料中的添加量约为100~200mg/kg,在添加剂预混合饲料中大于1000mg/kg,在称样量为2g时,配合饲料上样量定为10mL;添加剂预混合饲料上样量定为2mL。2.3.3洗脱溶剂及时间考察了75%乙腈水、25%乙腈水和纯水3种洗脱液,每次用2mL洗脱液,洗脱3次,结果见表3。由表3可知,75%的乙腈水洗3次后仍有个别磺胺类药物未被洗脱;而25%乙腈水、纯水在3次洗脱后,洗脱液中已无任何磺胺类药物。由于25%的乙腈水恰恰是流动相的组成,因此确定用25%的乙腈水2mL洗脱2次。2.4不同浓度磺胺类药物的加标回收将该方法用于鸡配合饲料和猪配合饲料中磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉等5种磺胺类药物的测定。考察了20、100、200mg/kg和400mg/kg浓度水平加标回收,回收率结果(5次平均)见表4、5。在鸡配合饲料中,4个浓度水平的磺胺类药物的回收率高于77.7%,RSD≤8.0;在猪配合饲料中,4个浓度水平的磺胺类药物的回收率高于80.2%,RSD≤8.7;由于在猪浓缩饲料中磺胺类药物添加量较高,因此只考察了一个浓度水平的回收率,结果见表6。3