银杏内生真菌多样性及演替分析

银杏内生真菌多样性及演替分析

1866年，deja指出植物中存在内生微生物。特别是在20世纪80年代之后，大量植物内生植物的资源得以挖掘，这证实内生植物在植物体内是普遍存在的（郭良东，2001）。从不同植物中分离到的内生真菌数量不同,Fisheretal(1993)从光叶大戟EucalyptusnitensMaiden上分离到60多种内生真菌。但是仅凭种数多寡来评价某种植物的内生真菌多样性丰富与否虽然直观却不够科学、客观和准确。另一方面,已有的研究资料表明:由于协同进化的作用使得某些内生真菌具有宿主专一性,平均每种植物有4-5种专性内生真菌(Petrini1991),因此,选择特有植物根据分离率分析内生真菌的特定组成和演替变化、运用多样性指数来评价其内生真菌的丰富度将有助于植物内生真菌多样性研究的深入。银杏GinkgobilobaL.是单科单属单种的多年生落叶乔木,为我国特有树种。其内生真菌的研究主要是由国内一些研究者开展,且主要集中在生物活性菌株的研究上,如对与宿主银杏相似的黄酮类化合物产生菌的分离和鉴定(王梅霞等2004;韩晓丽等2008),对产香的银杏内生镰刀菌G1024菌株的生物学特性和挥发性成分的研究(蒋继宏等2004;鞠秀云等2006),对银杏内生真菌抑菌活性的研究(申屠旭萍等2006,2007)等。在银杏内生真菌的多样性研究上,周松林等(2006)采用随机引物扩增多态性技术分析了银杏内生刺盘孢的遗传多样性,甘金莲等(2007)探讨了银杏内生真菌生态分布的一些特征,樊有赋等(2007)则研究了银杏内生真菌的种群多样性。本研究在江苏和山东两省的主要银杏栽培基地分别于春、夏、秋三季定点随机采样,通过菌种分离和鉴定以及分离率和多样性指数计算,分析了银杏叶部组织中内生真菌的组成、多样性和分布特征。1材料和方法1.1采样地和采样方式分别于2007年春季(5月)、夏季(8月)及秋季(11月)在5个样点(表1)采集银杏叶样品。在每一采样地点,随机选取相隔一定距离的若干健康的银杏植株采样。样品标记后置于保鲜袋中,于4℃保存,在12h之内对样品进行内生真菌的分离。1.2马铃薯、葡萄糖、水马铃薯、菌株马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂20g,水1000mL,pH值自然,临用时加250mg/L链霉素。1.3组织小段采用常规的真菌组织分离法(方中达1998)。叶片剪成0.5cm×0.5cm左右的组织小块,叶柄剪成1cm长的小段。每次分离均选取叶片组织块200个,叶柄组织块50个。1.4形态鉴定依照真菌的经典分类鉴定方法,从纯化后培养数日的菌落上挑取菌体制成切片,置于光学显微镜下观察菌丝、有性或无性孢子、产孢结构等的形态特征,鉴定到属。真菌分类鉴定的工具书主要为《真菌鉴定手册》(魏景超1979),半知菌的鉴定则主要依据Barnett&Hunter(1998)的系统,并根据Kirketal.(2001)追寻属的变动采用目前的属名和定义。1.5内生真菌群落生物多样性的分析方法采用分离频率比较判断优势菌群。分离频率(isolationfrequency,IF):分离到的某一指定类型内生真菌的菌株数占分离总的内生真菌菌株数的百分率。采用分离率衡量植物组织中内生真菌的丰富程度和每个组织块受多重侵染的发生频率。分离率(isolationrate,IR):分离到的某一指定类型内生真菌的菌株数占分离样品组织块总数的百分率。采用Shannon-Wiener指数(H)和Simpson指数(D)分析内生真菌的群落生物多样性。H=-Σ(Pi)(lnPi)、D=1-Σ(Pi)2,式中:Pi为属于种i的个体在全部个体中的比例;采用Evenness指数(J)分析群落物种分布的均匀程度。J=H/lnS,式中:H为Shannon-Wiener指数、S为物种总数目;采用Sorenson(Cs)及Jaccard(CJ)相似性系数比较两地之间内生真菌种类组成的相似程度。CS=2j/(a+b),CJ=j/(a+b-j),式中:j为两个样地共有种数或属数;a和b分别为样地A和样地B的物种数或属数。2结果分析2.1内生真菌的分类从五个地点三个季节采集的银杏叶中共分离得到内生真菌1971株,鉴定后归于32属,少数因不产孢而未鉴定出种属的暂归为一类——无孢菌群(Sterilemycelia)。分离得到的内生真菌多属于半知菌(94.82%),少数属于子囊菌(2.38%)。在目的分类水平上以半知菌中的丛梗孢目Moniliales和球壳孢目Sphaeropsidales为优势菌群,分别占总菌株数的37.85%和31%;在科的分类水平上以球壳孢科、暗梗孢科、黑盘孢科为优势菌群,分别占总菌株数的30.84%、27.84%和10.75%;在属的水平上以交链孢属Alternaria、叶点霉属Phyllosticta、丝核菌属Rhizoctonia为优势类群,分别占总菌株数的18.01%、14.66%和14.56%(表2)。2.2生津和细菌之间的差异分布2.2.1内部真菌在不同部位的分布2.2.2盘长孢属genusspis,拟茎点霉属u2004在5个采样调查地区之间,银杏叶中内生真菌的菌群组成存在差异,在分离率上表现为南京>启东>邳州>郯城>泰兴的规律(图1)。除共有的优势菌群以外,银杏叶部内生真菌还具有其各自地区的优势菌群。其中,南京为盘长孢属Gloeosporium(3.55%),泰兴为匐柄霉属Stemphylium(1.07%),启东为刺盘孢属Colletotrichum(3.65%),邳州为闭果霉属Sclerotiopsis(1.17%),郯城为拟茎点霉属Phomopsis(3.75%)。此外,部分内生真菌也具有一定的地理分布特性,泰兴为拟青霉属Paecilomyces(0.05%)和单格孢属Ulocladium(0.10%),郯城为丝葚霉属Papulospora(0.15%),邳州为黑腐菌属Guignardia(0.15%),南京为小丛壳属Glomerella(0.10%)(表3)。2.2.3菌株数量和种类在春、夏、秋三个季节中,春季内生真菌的分离率为7.76%,显著低于夏季的19.76%和秋季的25.04%(图1)。在菌株数量和种类上,春季仅为291株和16种,都明显低于夏季和秋季。夏季和秋季相比较,两者在种群类别上差异不大,分别为28种和31种,只是秋季菌株数量939株略高于夏季的741株。2.3内部空气的多样性2.3.1物种多样性指数秋季在郯城所分离获得的内生真菌菌群的Shannon-Wiener多样性指数最高(2.7102),夏季在启东获得的内生真菌菌群的Shannon-Wiener指数最低(1.3902)。Simpson多样性指数的范围在0到1之间,结果与Shannon-Wiener指数是一致的,仍然是秋季郯城的最高及夏季启东的最低,其指数分别为0.9041和0.6992(表4)。均匀度可以反映出群落中不同物种分布的均匀程度。通过对各内生真菌种群均匀度指数的计算发现,分离得到的内生真菌种群均匀度各不相同,均匀度指数都在0.6以上。其中以春季泰兴菌群的均匀度指数最高(0.9238),而夏季启东菌群的最低(0.6327)(表4)。2.3.2内生真菌菌群的相似性通过两种相似性系数Jaccard指数和Sorenson指数的计算结果的比较,发现从5个采集地点分离获得的内生真菌菌群的相似性系数均大于0.5(表5),这说明各地银杏内生真菌菌群之间具有一定的相似性。其中南京与郯城、泰兴与启东之间的内生真菌菌群有较高的相似性,它们之间的Jaccard指数和Sorenson指数分别为0.7586、0.7727和0.8627、0.8718(表5)。3研究发现与分析本研究所获得的银杏叶部组织的内生真菌类群普遍被认为腐生性较强,所采集的样本全部来自健康植株,宿主完全没有受到伤害或感染病害的症状,应该不会给腐生性真菌提供生长基质。叶部组织材料的表面消毒彻底,可以排除叶表的腐生菌和附生菌,因此,可以认为这些真菌是内生的或至少是部分内生且不引起植物病害,它们符合植物内生真菌的有关定义(Petrini1991;Stoneetal.2000)。但是,本研究获得的银杏内生真菌,除了闭果霉属Sclerotiopsis、射盾孢属Actinopelte和小丛壳属Glomerella等个别类群尚未在银杏以外的其它植物中见到报道外,其余大都已作为内生真菌被广泛分离报道,这可能与研究所采用分离培养基为通用培养基有关。考虑到不同的植物应有特定的专一性内生真菌物种,在今后的内生真菌资源研究中,多种选择性分离培养基的采用和将内生真菌鉴定到种的水平是必要的。研究表明银杏叶部组织内生真菌在叶片和叶柄两个部位的分布以及季节间存在差异。这可能是因为春季银杏叶柄部位发育较之叶片成熟,而到了夏季和秋季,随着叶片发育完全,表面积的逐渐增大,原有内生真菌从叶柄向叶片扩展、或是外部真菌增加了侵染机会所致。另一方面,银杏叶部组织中内生真菌的类群与分布在不同地理生境下也存在着差异,这说明内生真菌的类群和分布可能受到地理位置及其气候环境等因素的影响。研究结果表明,不同地区银杏叶部组织的内生真菌在春季的种群数量及分离率都是最少和最低的,而在夏季和秋季均有很明显的升高,这可能是与气候、环境、降雨量等外在条件的季节性变化有关,这与其他植物内生真菌研究的结果相一致(Larranetal.2001;Vujanovic&Brisson2002;Santamarı´a&Bayman2005;柯海丽等2007)。不过,决定植物内生真菌菌群分布、组成特征和演替变化的因素和作用机制既是多方面的又可能是较为复杂的,需深入研究。丰富度和均匀度指数是反映生境中真菌菌群分布的重要参数,相似性系数是反映两个不同生境中真菌菌群组成相似程度的重要参数。丰富度指数数值越大,表明种类越多,多样性越高;均匀度指数则反映着种类之间个体分配的均匀性,其值越大,多样性一般也越高;相似性系数越大,两个生境的多样性水平越接近。由本研究的多样性指数及相似性系数的结果可以得出这样的判断,各采样地点银杏叶部组织中的内生真菌菌群普遍具有较高的多样性,因为分别计算Shannon-Wiener指数和Simpson指数获得的多样性参数所反映出来的结果是一致的,并不因春季分离获得的菌群数量少些、夏季和秋季分离获得的菌群多些而呈现出季节间的波动,均匀度指数也同时表明本研究各采样地区内银杏叶部组织中的内生真菌多样性是比较稳定的,组成菌群的分配是比较均匀的。本研究采样地点中的江苏泰兴和山东郯城均被称为我国的银杏之乡,江苏邳州又与山东郯城相邻,银杏植株生长缓慢而时间较长,因此也促成了银杏内生真菌多样性的丰富和稳定。相似性系数的结果更反映出银杏叶部组织中的内生真菌多样性水平在