CMA芯片技术应用于辅助生殖植入前产前产后先天性疾病诊断的初步应用课件

CMA芯片技术应用于辅助生殖植入前/产前/产后

先天性疾病诊断的初步应用

浙江大学医学院附属妇产科医院1CMA芯片技术应用于辅助生殖植入前/产前/产后

先天性疾病诊出生缺陷出生时就有外表的、内部的结构异常或功能异常我国出生缺陷率达5.6%每年新增出生缺陷约90万例日益成为突出的公共卫生问题和社会问题2出生缺陷出生时就有外表的、内部的结构异常或功能异常2出生缺陷出生缺陷遗传因素环境因素（理、化、生物因素、生活方式）遗传+环境因素染色体异常（所有新生儿中，染色体异常占0.92%，多为新发而非遗传）单基因突变（多为孟德尔遗传，少数为新发）3出生缺陷出生缺陷遗传因素环境因素（理、化、生物因素、生活方式出生缺陷干预----关注生殖全程高危人群目标人群产前诊断孕前诊断不孕人群精子产后先天性疾病诊断卵子+胚胎胎儿新生儿、儿童4出生缺陷干预----关注生殖全程高危人群产前诊断孕前诊断不孕对胚胎或卵子行卵裂球或极体活检，作染色体和/或基因学检测，将无疾病胚胎植入子宫妊娠，并出生正常子代的技术辅助生殖与遗传学技术相结合的一种产前诊断方法关键点是建立单细胞遗传诊断技术孕前诊断-----植入前遗传学诊断技术

(preimplantationGeneticDiagnosis,PGD)5对胚胎或卵子行卵裂球或极体活检，作染色体和/或基因学检测，将染色体疾病的诊断在人类染色体研究历史上,研究者一直致力于利用可视化的显微镜分析染色体的完整性除了非整倍体，染色体微缺失、重复、扩增和等基因组DNA失衡是导致胎儿发育迟缓、畸形、死胎、流产和其他先天性疾病的内在原因6染色体疾病的诊断在人类染色体研究历史上,研究者一直致力于利用是目前较为成熟的遗传性疾病诊断技术传统核型分析技术绒毛活检取材孕中期羊膜腔穿刺羊水细胞培养染色体核型分析对非整倍体和重大染色体结构异常诊断的准确率达到99%7是目前较为成熟的遗传性疾病诊断技术传统核型分析技术绒毛活检取局限性材料受限，需要新鲜的组织、血样进行活细胞培养不能分辨长度在10Mb以下染色体片断的缺失、增加或易位染色体亚端粒区域异常诊断率较低单细胞分析

高分辨率分析8局限性材料受限，需要新鲜的组织、血样进行活细胞培养单细胞分析荧光原位杂交技术（fluorescentin-situhybridization，FISH)可对相应位点的缺失、重复、易位及多倍体等染色体异常作出诊断提高了染色体异常的诊断精度FISH探针能同时与分裂期染色体或间期核染色丝特异杂交----无需细胞培养，可用于单细胞分析Chromosome13q13-14Chromosome21q21荧光标记的DNA探针中期分裂相间期细胞核9荧光原位杂交技术（fluorescentin-situhFISH局限性只能对有限的位点进行检测FISH依赖于探针的设计，检测不明原因的病例难度较大对植入前胚胎的检测，缺乏覆盖全基因组检测的能力10FISH局限性只能对有限的位点进行检测10

Metaphasechromosomesblastomerenormal11normal22der11der22Reciprocaltranslocationt(11;22)(q25;q12)Metaphasechromosomesblastomerenormal13normal14der13-14Robertsoniantranslocationder(13;14)(q10;q10)FISHforstructuralaberrations2-colourFISH3-colourFISH11Metaphasechromosomesblast比较基因组杂交（comparativegenomichybridization,CGH)1：1混合杂交于同个正常男性中期分裂相Cot-1DNA双色荧光强度比分析

正常DNA

病人DNAGainLossLOSSGain12比较基因组杂交（comparativegenomich1：1混合杂交于芯片（BAC.Oligoarray，SNP)Cot-1DNA计算机扫描，数据分析

病人DNA

正常DNAGainLoss微阵列比较基因组杂交技术（ArrayComparativegenomichybridization，aCGH)131：1混合杂交于芯片（BAC.Oligoarray，SNP)1414aCGH优势结合了基因芯片和传统CGH的优点更高的分辨率：G-显带的分辨率：10Mb

传统CGH:5-10MbArrayCGH:100kb检测基因组的拷贝数变化，可对染色体非整倍体、微缺失或微重复或其他不平衡的染色体异常检测能够对染色体异常进行精确定位结合全基因扩增技术，可以进行胚胎全染色体组的检测------PGS/PGD15aCGH优势结合了基因芯片和传统CGH的优点151616用于检测CNV的染色体芯片（CMA)在下列情况应作为一线检测手段非已知综合症的多发畸形非综合症型的发育迟缓/智力低下孤独症谱系疾病进一步明确发育迟缓、语言发育落后和其他尚不明确遗传学病因的症状对于一些CMA检出不平衡的病例，建议用细胞遗传/FISH进行确认，同时对父母进行临床遗传评估和咨询17用于检测CNV的染色体芯片（CMA)在下列情况应作为一线检测TheAmericanJournalofHumanGenetics86,749–764,May14,201021698例不明原因发育迟缓、低智，孤独症，多发畸形芯片（CMA)检测：诊断率15%-20%核型分析：诊断率仅3%

发育障碍和智力低下等先天疾病首选CMA18TheAmericanJournalofHuman截止2011年，智力低下的arrayCGH研究论文就达4370篇1919CMA技术平台Affymetrix芯片平台

产前、产后检测Bluegenome芯片平台植入前胚胎检测20CMA技术平台Affymetrix芯片平台BluegenoCMA的应用在辅助生殖临床上进行全染色体范围的非整倍体筛查在反复自然流产原因分析补充产前诊断的一个重要手段在智力低下、发育迟缓和体征多种畸形儿童致病原因分析在儿童自闭症原因分析21CMA的应用在辅助生殖临床上进行全染色体范围的非整倍体筛查2高龄产妇复植入失败复发性早期流产严重的男性不育症父母为平衡易位、倒位携带者非整倍体是辅助生殖低妊娠率和高流产率的主要因素，PGS的目的是识别整倍体的正常胚胎转移，以实现增加怀孕的机会CMA植入前胚胎遗传学筛查/诊断适应人群22高龄产妇CMA植入前胚胎遗传学筛查/诊断适应人群22CMA产前诊断适应人群希望更全面、更准确的了解胎儿染色体情况，以排除出生缺陷的可能性（生长发育迟缓，智力低下、自闭症等原因）胎儿B超检查发现结构异常，但染色体核型分析正常者羊水染色体核型分析已发现异常，但无法确定异常染色体的确切位置或来源者胎儿发现新发的染色体相互易位，需进一步排除微缺失者23CMA产前诊断适应人群希望更全面、更准确的了解胎儿染色体情况CMA检测先天性疾病的适应症不同程度的智力低下生长发育迟缓、语言发育迟缓面容异常内脏器官（如心脏、肾脏、生殖器）畸形认知/精神/行为问题（如多动症、自闭症）24CMA检测先天性疾病的适应症不同程度的智力低下24截止12年10月，共收病人233例

植入前诊断病例7例

难免流产流产物分析121例

产前诊断病例50例

产后先天性疾病诊断55例CMA检测病例25截止12年10月，共收病人233例

植入前诊断病例7例

难植入前诊断病例反复流产反复IVF失败父母为平衡易位携带者产前诊断病例新发平衡易位胎儿，排除染色体微缺失父母为平衡易位携带者B超诊断结构异常胎儿：脑部结构异常、先心、肾增大、单脐动脉、羊水过多、淋巴水囊瘤产后诊断自闭症脑发育不全/智力低下先天性心脏病26植入前诊断病例26检测标本活检的单个卵裂球绒毛引产胎儿组织羊水脐血外周血27检测标本活检的单个卵裂球27Transfer(FreshCycle)NormalEmbryosWGAArray-CGHArray-CGHresultsSurePlexBluegnome24SureBluegnomeBlueFuseMultiD3Cleavagestageembryo单细胞ArrayCGH过程AneuploidyScreening(PGS)PGDStructuralChromosomalAbnormalities28Transfer(FreshCycle)Nor用QIAampDNAMiniKit(QIAGEN)提取纯化DNABluegnomeCytoChipFocusConstitutional芯片AffymetrixCytoScanHD&SNP6.0ReferenceDNA:NormalPromegaMale

NormalAsianMale检测主要试剂29用QIAampDNAMiniKit(QIAGEN)提主要步骤30主要步骤30后续验证主要方法MLPAFISHPCR多重连接探针扩增技术(MLPA)31后续验证主要方法MLPA多重连接探针扩增技术(MLPA)3初步总结植入前诊断病例6例病人，共32个胚胎进行了arrayCGH检测其中2例患者的所有胚胎检测结果异常，未获得可移植的正常胚胎4例患者得到可移植的胚胎，2例获得成功妊娠，目前已孕30周，继续妊娠中。32初步总结植入前诊断病例32产前诊断病例核型含衍生染色体的羊水标本全部检出染色体的异常来源死胎或胚胎停育病例中46.9%检出了染色体拷贝数增加/减少，含16,15,21，22,18号等染色体的非整倍体，染色体拷贝数增加的片段包括4q13.2-q35.2，