实验三 质粒DNA的酶切鉴定

分子生物学实验

Experimentsofmolecularbiology授课教师：田生礼实验三质粒DNA的酶切鉴定实验三质粒DNA的酶切鉴定【目的要求】1．了解一般限制性内切酶的特性；2．学习设计酶切方案的一般规律,载体与供体进行酶切；3．掌握酶的保存与使用方法；【实验原理】

限制性内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的特定的核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶，共有I型、、II型、III型三类，II型限制性内切酶识别含4－8个核苷酸且具有回文对称性质的核酸序列，并在识别序列内或侧旁特异性位点切开DNA双链，产生平齐末端和带单链突出端（粘性末端）的DNA片断，常用于基因克隆的载体切割、外源DNA的制备。在分子克隆中I、III类型限制性内切酶都不常用。【实验器材】台式离心机、振荡器，恒温水浴，微量移液器（20uL,200uL1000uL）,1.5mLEnpendorf管。

【实验材料】限制性内切酶（BamHI和XhoI）及酶切缓冲液、无菌水，质粒DNA溶液。

【实验内容】1．酶切有关基础知识介绍：2．小量酶切，电泳鉴定。3.酶切体系的建立：

成分单酶切双酶切质粒（T-AD）101010X缓冲液22去离子水76BamHI11XhoI---1总体积20ul20ul37度水浴1个小时酶切电泳图M：DL5,000DNAMarker；1：质粒DNA；2单酶切质粒DNA（BamHI）；3：双酶切质粒DNA（BamHI和XhoI）。影响限制性内切酶的因素很多，酶反应条件是实验成功的重要因素，其中包括反应的温度、时间与反应的缓冲体系、DNA的纯度和浓度等。酶切反应体系的组成：DNA量→酶量（最多占总体积的1/10）→总体积，即根据所用DNA的量确定用酶量，再根据用的酶量确定总体积。一般较好的酶切反应体系中DNA用量不高于1.5ug/50uL。酶切时加样顺序一般应为：水+缓冲液+DNA+酶，以保证酶的活性。向管中加入每个组分后都要用手指轻拨管子以利混匀，最后加酶混匀，离心后保温酶切。I型限制性内切核酸酶有其特定的DNA识别序列，但酶在DNA上的切割位置远离其识别位置，有的酶可在同识别序列相距1000bp的位置上随机切割。l型限制酶对体外重组DNA实验没有多少用处。III型限制性内切核酸酶在DNA上有其特定的识别序列，其酶切位置在识别序列3‘端之外相距约20个碱基对处，可以产生各种类型的单链末端。Ⅲ型酶有其特定的用途。II限制性内切核酸酶在DNA上有其特定的识别序列即，回文结构，通常为4-8bp，在特定识别位点处切割DNA。是基因工程中主要使用的酶类。限制性内切酶分类限制酶特点：1.识别４-8个相连的核苷酸，以6个多见；限制性内切酶的识别序列

BamHI5’-G

GATCC-3’3’-CCTAG

G-5’NotI5’-GC

GGCCGC-3’

3’-CGCCGG

CG-5’2.呈回文结构(palindrome)；3.旋转对称性；EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

4.切点大多数在识别顺序之内，也有例外。FokI5’-GGATGNN

-3’3’-CCTAC

NN-5’外侧，产生3’-端突起5.识别序列严格，少数有变动，序列中的核苷酸被甲基化后，不能被切割。限制性内切酶的切割方式内切酶切割后产生的三种末端a)5’突出的粘性末端如,EcoRI5’-G

AATTC-3’3’-CTTAA

G-5’b)3’突出的粘性末端如,PstI5’-CTGCA

G-3’3’-G

ACGTC-5’c)平末端如,SmaI5’-CCC

GGG-3’3’-GGG

CCC-5’同裂酶:能识别相同序列，切割位点可以相同也可以不同，来源不同的酶。（1）同裂酶（Isoschizomers)①完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。如HindⅢ和HsuI。HindⅢ5’-A

AGCTT-3’3’-TTCGA

A-5’HsuI5’-A

AGCTT-3’3’-TTCGA

A-5’同列裂酶和同尾酶XmaI5’-C

CCGGG-3’3’-GGGCC

C-5’SmaI5’-CCC

GGG-3’3’-GGG

CCC-5’识别位点相同，但切点不同。如XmaI和SmaI。②不完全同裂酶：Asp718I5’-G

GTACC-3’3’-CCATG

G-5’KpnI5’-GGTAC

C-3’3’-C

CATGG-5’同尾酶(Isocaudamers):识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等（2）同尾酶(Isocaudamers）5’-G

GATCC-3’3’-CCTAG

G-5’BamHIBclI5’-T

GATCA-3’3’-ACTAG

T-5’

5’-A

GATCT-3’3’-TCTAG

A-5’BglⅡ5’-U

GATCY-3’3’-YCTAG

U-5’XhoⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。5’-

GATC----3’3’----CTAG

-5’

Sau3A同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。？5’-G3’-CCTAGGATCT-3’

A-5’BamHIBglⅡ

5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’BamHIBglⅡSau3A部分同裂酶的切割位点EnzymeSequenceIsoschizomersAcc65IGGTACCCCATGGAsp718I,KpnIAhaIIITTTAAA

AAATTTDraIBstMAICTGCAGGACGTCPstIEcoRIGAATTCCTTAAGFunIINdeICATATGGTATACFauNDINheIGCTAGCCGATCGAsuNHI,BmtINotIGCGGCCGCCGCCGGCGCciNISmaICCCGGGGGGCCCCfr9I,PspAI,XmaI,XmaCI部分同尾酶切割位点EnzymeSequenceIsoschizomersBamHI5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BclI,BglII5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’BamHI,BglIIBglII5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BclI,BamHIPstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-3’NsiI,5’-ATGCAT-3’