比浊法测定抗生素

比浊法测定抗生素生药1021 戴济锋一、 实验目的掌握比浊法测定的原理及方法；学会标准曲线的制作和培养基的制备。二、 实验原理细菌接种于澄清的营养丰富的液体培养基中，在一定的温度下培养一段时间，变浑浊，其浑浊程度与细菌生长的浊度与细菌数的增加，细菌群体质量的增加和细菌细胞容积的增加之间，存在直接关系，可用朗伯-比尔定律形式表示。logI0/I=A=NEab/2.310：入射光的强度I：透射光的强度N：细菌的质量E：细菌颗粒的吸收系数a：细菌颗粒的光学有效面积b：细菌悬液的厚度在抗生素存在时，理论的剂量反应方程为：Nt=N0exp[K0+f（V）Km-KaC]tNt：培养t时间后细菌的质量N0：开始培养时细菌的质量K0：在无抗生素存在时，细菌繁殖代数的速度常数C：抗生素浓度，Ka为其抑制常数，Km为溶剂效应f（v）：试管内样品体积的函数实际上，上面的N0、K0、f（v）、Km、Ka和t不能确知，但在各试管内均相同为一常数，因此，可简化为logN=G+BCG：直线的截距B：直线的斜率C：抗生素的浓度如1ogN用细菌悬液的吸收度表示，则logA=E+FC因此，在剂量反应曲线的直线范围内，可设计微生物浊度法测定抗生素的含量。三、 实验试剂、材料及设备材料：金黄色葡萄球菌试剂：营养肉汤培养基（蛋白胨10g，琼脂15〜20g，氯化钠5g，肉浸液1000ml,;除琼脂为，混合上述成分，调节pH使比最终的pH略高0.2〜0.4，加入琼脂，加热溶化后虑过，调节pH使灭菌后为7.2〜7.4，分装，在121^灭菌30分钟，趁热释放使凝固成斜面。）、无菌水、0.9%灭菌氯化钠溶液、甲醛溶液、抗生素标准品、抗生素供试品，灭菌缓冲液。设备：立式整齐灭菌锅、培养箱、检测仪、试管、烧杯、天平、电炉等。四、 实验步骤（一）、准备工作1.试管的准备（1）.新试管经洗净后，用160°C干烤1〜3小时灭菌，注意保持清洁，避免被抗生素、抑菌物质、毛点、纤维污染。（2）.使用过的试管经灭菌后，将培养基倒出，先用清水冲洗，必要时用硫酸-重铬酸钾洗液浸泡、清水冲洗，然后再用纯化水冲洗干净后，晾干，再经160C干烤1〜3小时灭菌，备用。其他玻璃器具的准备其他玻璃器具如称量瓶、容量瓶、滴定管等，先用清水冲洗，再用清洁液或洗液浸泡1-2h，然后用水、纯化水冲洗干净，淋干，置于相应托架，室温干燥。培养基的制备按照药典附录XI中培养基m的规定进行配置，并按要求调节pH值，使灭菌后的pH值在7.0〜7.2之间，根据我们的实验m号培养基灭菌后要比灭菌前的pH值下降0.1-0.2个单位。所以在灭菌前调节pH值时要稍高于规定pH值。试验用菌悬液的制备（以金葡菌［Stap-hylococcusaureus］为例）取金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］的营养琼脂斜面培养物，接种至营养琼脂斜面上，在35-37C培养20-22小时，临用时，用灭菌水或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下制成悬液，备用。含菌培养基的制备临用前，取规定的试验菌悬液适量（35-37C培养3-4小时后测定的吸光度值在0.3-0.7之间，且剂距为2的相邻剂量间的吸光度差值不小于0.1），加入到各规定的液体培养基中，混合，使在试验条件下能得到满意的剂量-反应关系和适宜的测定浊度。已接种试验菌的液体培养基应立即使用。标准品溶液的制备标准品的使用和保存应照标准品说明书的规定。临用时照下页表1中的规定进行稀释。供试品溶液的制备精密称（或量）取供试品适量，用各品种项下规定的溶剂溶解后，再按估计效价或标示量照下页表1中的规定稀释至与标准品相当的浓度。表1抗生素微生物检定浊度法试验设计表抗生素类别试验菌培养基火菌缓冲液pH值抗生素浓度范围单位/ml培养条件编号pH值温度。C庆大霉素金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］m7.0〜7.27.80.15〜1.035〜37（二）标准曲线法简介除另有规定外，取适宜的大小厚度均匀的已灭菌试管，在各种品种项下规定的剂量反应线性范围内，以线性浓度范围的中间值作为中间浓度，标准品溶液选择5个剂量，剂量间的比例应适宜（通常为1：1.25或更小），供试品根据估计效价或标示量溶液选择中间剂量，每一剂量不少于3个试管。在各试管内精密加入各浓度的含菌液体培养基9.0ml，再分别精密加入各浓度的标准品或供试品溶液各1.0ml，（USP28、EP5及JPXW中加入顺序为先加入标准品或供试品溶液，再加入含菌培养基）立即混匀，按随机区组分配将各管在规定条件下培养至适宜测量的浊度值（通常约为4h），在线测定或取出立即加入甲醛溶液（1-3）0.5ml以终止微生物生长，在530nm或580nm波长处测定各管的吸光度。同时另取2支试管各加入药品稀释剂1.0ml，再分别加入含试验菌的液体培养基9.0ml,其中一支试管与上述各管同法操作作为细菌生长情况的阳性对照，另一支试管立即加入甲醛溶液0.5ml，混匀，作为吸光度测定的空白液。照CP2005版规定的标准曲线法进行可靠性检验和效价计算。（三） 、抗生素稀释取相应抗生素，照药典规定制备1000u/ml溶液，根据预实验中确定的浓度用pH7.8的磷酸盐缓冲液，同步稀释标准品和样品，每步稀释时标准品和样品最好用同一支刻度吸管或移液管，以消除吸管间的系统误差。（四） 、加样精密吸取稀释好的抗生素溶液1.00ml，按拉丁方阵排列方法或随机排列顺序加入各个试管中，加样时需要按从低浓度到高浓度的顺序，使用同一支刻度吸管吸取溶液，以减小由于各浓度溶液所使用刻度吸管的不同引起的误差。（五） 、加含菌培养基按照预实验中所得的结果，吸取实验用适量于培养基中，摇匀，用灭菌刻度吸管吸取9.0ml，分装于各个试管中。（六） 、培养将加好抗生素溶液及带菌培养基的试管放在37±0.1°C下培养3-4小时。（七） 、检测如能保证在20秒内完成全部2批样品（40支比色皿）测量过程，则不需要灭菌，否则需需将比色皿或大试管取出，立即加入（1-3）甲醛溶液0.50ml，摇匀，再进行测量，以保证测量结果的准确性。五、抗生素微生物检定法标准曲线法的计算1.标准曲线的计算标准品的各浓度lg值及相对应的吸光度按下图公式（1）和（2）分别计算标准曲线的直线回归系数（即斜率）b和截距a，从而得到相应标准曲线的直线回归方程（3）:£（尤-x）（y-y）£xy-x£yTOC\o"1-5"\h\z回归系数：b=—£「——=£■_£ ⑴"（x-x）2 "x2-X"x\o"CurrentDocument"i i i截距：a=y-bx ⑵直线回归方程：Y=bX+a ⑶式中 y.为标准品的实际吸光度；Y为估计吸光度［由标准曲线的直线回归方程（3）计算得到］;y为标准品实际吸光度的均值；x.为抗生素标准品实际浓度