组织学与胚胎学课件

第14章

DNA的生物合成（复制）DNABiosynthesis(Replication)第14章DNA的生物合成（复制）复制(replication)

是以DNA为模板的DNA合成，是基因组的复制过程。在这个过程中，亲代DNA作为合成模板，按照碱基配对原则合成子代分子，其化学本质是酶促脱氧核苷酸聚合反应。

复制亲代DNA子代DNA复制(replication)是以DNA为模板的DNA合成本章主要内容：DNA复制的基本规律DNA复制的酶学和拓扑学变化原核生物DNA复制的过程真核生物DNA生物合成过程逆转录和其他复制方式本章主要内容：DNA复制的基本规律DNA复制的基本特征BasicRulesofDNAReplication第一节DNA复制的基本特征第一节复制的方式——半保留复制

(semi-

conservativereplication)

双向复制

(bidirectional

replication)

半不连续复制

(semi-discontinuousreplication)一、复制的基本规律：复制的方式——半保留复制(semi-conserva

DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。（一）半保留复制概念:DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC母链DNACCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTG复制过程中形成的复制叉AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+子代DNAAT母链DNACGATTA复制过程中形成的复制叉ATAT+子按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。半保留复制的意义:遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子原核生物复制时，DNA从起始点向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉(replicationfork)，称为双向复制。复制中的复制叉的形成（二）DNA复制从起始点向两个方向延伸复制叉原核生物复制时，DNA从起始点向两个方向解链，形成两个延伸方A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter)oriterABCA.环状双链DNA及复制起始点oriterA真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。5’3’oriorioriori5’3’真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两5’5’3’3’5’3’oriorioriori5’3’复制子5’5’3’3’解链方向ori5’5’3’3’5’3’oriorioriori5’3’复制（三）DNA一股子链复制的方向与解链方向相反导致半不连续复制3´5´3´3´5´3

5

3

5

解链方向领头链(leadingstrand)后随链(laggingstrand)（三）DNA一股子链复制的方向与解链方向相反导致半不连续复领头链(leadingstrand)

：顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链。后随链(laggingstrand)

：另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为后随链。冈崎片段(okazakifragment)

：复制中后随链上的不连续片段。半不连续复制：领头链连续复制而随从链不连续复制。领头链(leadingstrand)：顺着解链方向生成的DNA复制的酶学和拓扑学变化第二节TheEnzymologyandTopologyofDNAReplicationDNA复制的酶学和拓扑学变化第二节TheEnzymol参与DNA复制的物质:底物(substrate)：dATP,dGTP,dCTP,dTTP；模板(template)：解开成单链的DNA母链；引物(primer)：提供3

-OH末端使dNTP可以依次聚合；聚合酶(polymerase):

依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DNA-pol；其他的酶和蛋白质因子。参与DNA复制的物质:底物(substrate)：dATP核苷酸和核苷酸之间生成磷酸二酯键(dNMP)n

+dNTP→(dNMP)n+1

+PPi核苷酸和核苷酸之间生成磷酸二酯键(dNMP)n+dNTP聚合反应的特点:DNA新链生成需引物和模板；新链的延长只可沿5→3

方向进行。聚合反应的特点:DNA新链生成需引物和模板；一、DNA聚合酶催化核苷酸之间聚合全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)简称：DNA-pol活性：1)5

3

的聚合活性2)核酸外切酶活性一、DNA聚合酶催化核苷酸之间聚合全称：依赖DNA的DNA聚5´CGCTTCAGGATA

3´

|||||||||||3´TCGAAGTCCTAGCGAC5´3

5

外切酶活性:5

3

外切酶活性:?能切除突变的DNA片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。核酸外切酶活性:

5´CGCTTCAGDNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ（一）原核生物的DNA聚合酶分为三型DNA-polⅠ（一）原核生物的DNA聚合酶分为三型催化DNA聚合参与DNA损伤的应急状态修复修复合成、切除引物、填补空隙功能20？400分子数/细胞10？1亚基数－－+5外切酶活性+++

5外切酶活性+++5聚合酶活性polIIIpolIIpolI原核生物中的DNA聚合酶催化DNA聚合参与DNA损伤的应急状态修复修复合成、切除引物功能：1.DNA-pol（109kD）对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。功能：1.DNA-pol（109kD）对复制中的错误进323个氨基酸小片段5

核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604个氨基酸DNA聚合酶活性

5

核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Kl2.DNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因发生突变，细菌依然能存活。DNA-polⅡ对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。2.DNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基功能：3.DNA-polⅢ

(250kD)是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。功能：3.DNA-polⅢ(250kD)是原核生物复２个核心酶1个

-复合物（

、

、

、

、

、

6种亚基）1对

-亚基（可滑动的DNA夹子）DNA聚合酶Ⅲ全酶结构全酶结构包括：２个核心酶DNA聚合酶Ⅲ全酶结构全酶结构包括：（二）常见的真核细胞DNA聚合酶有五种起始引发，引物酶活性++--高高高？中12.514.04.016.5分子量(kD)εδγβαDNA-pol填补引物空隙，切除修复，重组线粒体DNA复制5¢→3¢聚合酶活性16.5参与损伤与修复生物学功能3¢→5¢外切酶活性延长子链的主要酶，解螺旋酶活性+25.5（二）常见的真核细胞DNA聚合酶有五种起始引发，引物酶活性+二、DNA聚合酶的碱基选择和校对功能实现复制的保真性复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。二、DNA聚合酶的碱基选择和校对功能实现复制的保真性复制按照遵守严格的碱基配对规律；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；复制出错时DNA-pol的及时校读功能。DNA复制的保真性至少要依赖三种机制：遵守严格的碱基配对规律；DNA复制的保真性至少要依赖三种机制（一）复制的保真性依赖正确的碱基选择DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。

（一）复制的保真性依赖正确的碱基选择DNA聚合酶靠其大分子结（二）核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的酶，外切酶是有方向性的。

（二）核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正核酸外A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，DNA-pol不表现活性。DNApolⅠ的校读功能A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺三、复制中的解链伴有DNA分子拓扑学变化DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。

三、复制中的解链伴有DNA分子拓扑学变化DNA分子的碱基埋在（一）解螺旋酶（helicase）

DnaB蛋白：

利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。DnaBDnaC解链方向（一）解螺旋酶（helicase）DnaB蛋白：DDNA聚合酶不能从头合成DNA链，只能延长已有的DNA或RNA引物链。引物酶在复制起始时催化RNA引物合成，提供3

-OH末端，使DNA-pol能够催化dNTP聚合。（二）引物酶（Primase）DNA聚合酶不能从头合成DNA链，只能延长已有的DNA或RN5´3´5´RNA引物5´5´RNA引物3´引物酶属DNA指导的RNA聚合酶，但不同于催化转录过程的RNA聚合酶。在E.coli，引物酶是dnaG基因的产物DnaG。5´3´5´RNA引物5´5´RNA引物3´引物酶属DN（三）单链DNA结合蛋白（SSB）在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。（三）单链DNA结合蛋白（SSB）在复制中维持模板108局部解链后（四）DNA拓扑异构酶复制过程正超螺旋的形成：改变DNA超螺旋状态、理顺DNA链108局部解链后（四）DNA拓扑异构酶复制过程正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成既能水解、又能连接磷酸二酯键。拓扑异构酶Ⅰ

拓扑异构酶Ⅱ拓扑异构酶分类：拓扑异构酶作用特点：既能水解、又能连接磷酸二酯键。拓扑异构酶Ⅰ拓扑异构酶分类拓扑异构酶Ⅰ切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。拓扑异构酶Ⅱ切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。作用机制：拓扑异构酶Ⅰ切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结拓扑酶的作用方式：拓扑酶的作用方式：组织学与胚胎学课件连接DNA链3

-OH末端和相邻DNA链5

-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。1.DNA连接酶的作用方式：（五）DNA连接酶（DNAligase）连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者HO5’3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’3’2.DNA连接酶的作用：OPO-O-OOPOO-OHO5’3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’3’在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。3.DNA连接酶的功能：在复制中起最后接合缺口的作用。3.DNA连接酶的功能：原核生物DNA复制过程TheProcessofDNAReplicationinprokaryotes第三节原核生物DNA复制过程第三节DNA的复制过程复制的起始链的延长复制的终止DNA的复制过程复制的起始一、复制起始：DNA解链形成引发体需要解决两个问题：1.DNA解开成单链，提供模板。2.形成引发体，合成引物，提供3-OH末端。一、复制起始：DNA解链形成引发体需要解决两个问题：1.E.coli复制起始点oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245串联重复序列反向重复序列5

3

5

3

1.DNA解链E.coli复制起始点oriCGATTNTTTATTT··3

5

3

5

2.引发体的形成和引物合成含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。DnaADNA拓扑异构酶DnaB、DnaC引物酶SSB35352.引发体的形成和引物合成含有解螺旋酶、D3

5

3

5

引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。引物3'HO5'引物酶3535引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。引物引发体和复制叉的生成引发体和复制叉的生成二、DNA的延长复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。

二、DNA的延长复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTP领头链的合成：领头链的子链沿着5

→3

方向可以连续地延长。领头链的合成：领头链的子链沿着5→3方向可以连续地延长。后随链的合成后随链的合成同一复制叉上领头链和随从链由相同的DNA-pol催化延长

同一复制叉上领头链和随从链由相同的DNA-pol催化延长复制过程简图冈崎片段复制过程简图冈崎片段原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。oriter

E.coli8232SV40oriter500三、复制的终止原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(5

5

5

RNA酶OHP5

DNA-polⅠdNTP5

5

PATPADP+Pi5

5

DNA连接酶子链中的RNA引物被取代：555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP5DNA连接酶DNA连接酶真核生物DNA生物合成过程TheProcessofDNABiosynthesisineukaryotes第四节真核生物DNA生物合成过程第四节哺乳动物的细胞周期DNA合成期G1G2SM

真核生物DNA复制在细胞周期的S期进行，也可分为起始、延长和终止三个阶段，每个阶段的基本过程与原核生物DNA复制相似，但存在不少差异。

哺乳动物的细胞周期DNA合成期G1G2SM真核生物与原核生物DNA复制的差异：真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉前进速度慢等；DNA复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚合酶

/

转换；切除冈崎片段RNA引物的是核酸酶RNAseHⅠ和FEN1等。

真核生物与原核生物DNA复制的差异：真核生物复制子多、冈崎片真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。复制的起始需要DNA-polα(引物酶活性)和polδ(解螺旋酶活性)参与。还需拓扑酶和复制因子(RF)。

一、真核生物复制的起始与原核基本相似真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性增殖细胞核抗原（proliferationcellnuclearantigen，PCNA）在复制起始和延长中起关键作用，PCNA

形成闭合环形的可滑动DNA夹子，在RFC的作用下结合于引物－模板链，可以使DNA-polδ获得持续合成能力。PCNA水平也是检验细胞增殖的重要指标。增殖细胞核抗原（proliferationcellnucDNA-polδ和polα分别兼有解螺旋酶和引物酶活性。在复制叉及引物生成后，polδ通过PCNA的协同作用逐步取代polα，在RNA引物的3

-OH基础上连续合成领头链。随从链合成方式也与其相似。

二、真核生物复制的延长发生DNA聚合酶α/δ转换DNA-polδ和polα分别兼有解螺旋酶和引物酶活性。3

5

5

3

领头链3

5

3

5

亲代DNA后随链引物核小体三、真核生物DNA合成后立即组装成核小体

3553领头链3535亲代DNA后随链引物核染色体DNA呈线状，复制在末端停止。复制中有冈崎片段的连接，还有复制子之间的连接。染色体两端DNA子链上最后复制的5‘端RNA引物，去除后留下缺口。四、端粒酶参与解决染色体末端复制问题染色体DNA呈线状，复制在末端停止。四、端粒酶参与解决染色体线性DNA复制的末端前导链产生完整的子染色单体。后随链3

端留下缩短的未复制的ssDNA区。线性DNA复制的末端前导链产生完整的子染色单体。5

3

3

55

3

3

5+5

3

3

3

3

5

5

53355335+5333355端粒(telomere)：指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。端粒酶参与解决染色体末端复制问题端粒(telomere)：指真核生物染色体线性DNA分子末端粒的功能：维持染色体的稳定性维持DNA复制的完整性端粒的结构特点：由末端单链DNA序列和蛋白质构成。末端DNA序列是多次重复的富含TG碱基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…端粒的功能：维持染色体的稳定性端粒的结构特点：由末端单链DN端粒酶(telomerase)端粒酶RNA(hTR)端粒酶协同蛋白(hTP1)端粒酶逆转录酶(hTRT)

组成：

生殖细胞、胚胎细胞和肿瘤细胞中有端粒酶，但正常人体细胞中无端粒酶，每进行一次DNA复制，缩短的序列是端粒序列。端粒酶(telomerase)端粒酶RNA(hTR)组成：端粒酶的爬行模型端粒酶的爬行模型逆转录和其他复制方式ReverseTranscription&OtherDNAReplicationWays第五节逆转录和其他复制方式第五节某些病毒的遗传物质是RNA。少数低等生物如M13噬菌体，它的感染型只含单链DNA。原核生物的质粒，真核生物的线粒体DNA，都是染色体外存在的DNA。这些非染色体基因组，采用特殊的方式进行复制。组织学与胚胎学课件逆转录(reversetranscription)在逆转录酶的作用下，以RNA为模板合成DNA的过程。逆转录酶一、逆转录病毒的基因组RNA以逆转录机制复制RNADNA逆转录(reversetranscription)在逆（一）逆转录过程逆转录酶RNA酶逆转录酶RNARNA-DNA

杂交体单链DNA双链DNA（一）逆转录过程逆转录酶RNA酶逆转录酶RNARNA-DNA整合到宿主细胞的染色体DNA中整合到宿主细胞的染色体DNA中分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。

以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。

试管内合成cDNA:cDNAcomplementaryDNA：逆转录酶

AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要（二）逆转录的发现发展了中心法则

1.逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现，发展了中心法则。

2.逆转录现象说明至少在某些生物，R