温度对雨生红球藻叶绿素荧光特性及虾青素含量的影响

温度对雨生红球藻叶绿素荧光特性及虾青素含量的影响

温度对虾青素积累和叶绿素荧光参数的影响虾青素也被称为“虾黄素”。这是一种从虾蟹外壳、牡蛎、鱼类、藻类和真菌中发现的红色维生素。研究表明,虾青素具有极高的经济价值,可用于鲑鱼、三文鱼等水产动物及家禽、家畜的养殖,提高产品的品质;天然虾青素有较强的抗氧化活性,具有清除自由基、保护血管、降低胆固醇、护肤等多方面的营养保健作用。雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)是一种淡水的单细胞绿藻,该藻在不利的生长环境下,如在缺乏氮、磷或在强光照射下,藻细胞的生长将趋于缓慢,同时会促进次生代谢产物虾青素的大量积累,使藻细胞的颜色迅速变红。该藻中虾青素的含量最高可达细胞干重的2%～4%,一般为微生物中类胡萝卜素含量的10～50倍,被公认为自然界中天然虾青素含量最高的生物,是用来获取天然虾青素的理想材料。温度对雨生红球藻的生长和虾青素的累积有很大影响,已有不少作者研究了温度对雨生红球藻生长速率的影响;温度对虾青素积累的影响也有报道;但同时研究温度对雨生红球藻叶绿素荧光参数及虾青素含量的影响却少有报道。大量研究[10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20]表明,叶绿素荧光是光合作用的良好指标和探针,叶绿素荧光参数是鉴定植物耐逆境能力良好指标之一,具有简单、快速、准确的优点,通过对各种荧光参数的分析,可以得到有关光能利用途径的信息,也可以反映植物受胁迫的情况。本实验通过叶绿素荧光技术来检测雨生红球藻在不同温度下的叶绿素荧光参数的变化规律,揭示叶绿素荧光参数与细胞密度的相关性,以此来检验叶绿素荧光技术在雨生红球藻选育中应用的可行性,并以此探讨温度胁迫对雨生红球藻虾青素累积速率的影响,为进一步大规模提取虾青素、利用雨生红球藻提供理论依据。1材料和方法1.1藻类藻类实验所用雨生红球藻Haematococcuspluvialisi藻种由中国科学院海洋研究所提供。1.2设置光照强度及光照周期实验在500mL的三角烧瓶中进行,均采用f/2培养基,温度分别为5、10、15、20、25、30和35℃,每个温度设3个平行组,光照强度为100μmol·m-2s-1,光照周期为16L∶8D,培养过程中不充气,每日随机调换三角瓶并摇动2～3次,培养时间为10d。每天定时取样,进行叶绿素荧光各项参数、叶绿素含量及细胞密度的测定,在指数生长末期收获,测定虾青素含量。1.3适应15min用Water-PAM水样叶绿素荧光仪(Walz,Effeltrich,Germany)进行叶绿素荧光各个参数的测定。测量前将微藻样品暗适应15min。叶绿素荧光参数PSⅡ的最大光能转化效率Fv/Fm、PSⅡ的实际光能转化效率ΦPSⅡ、光合电子传递效率ETR、光化学淬灭qP和非光化学淬灭NPQ可在荧光仪上直接读出,PSⅡ的潜在活性Fv/Fo则用公式(Fm-Fo)/Fo计算出,其中Fo(基础荧光)用弱测量光(0.01μmol·m-2s-1)测量可得,用饱和脉冲(4000μmol·m-2s-1,持续时间为0.8s)激发可得Fm(最大荧光)。1.4叶绿素含量测定用Water-PAM水样叶绿素荧光仪(Walz,Effectnich,Germany)进行叶绿素含量的测定,由于瞬间荧光产量(F值)和叶绿素浓度在一定范围内成正比,通过校正可测出叶绿素含量。为避免校正过程中可能产生的误差,文中的叶绿素含量用相对含量(每次测得的叶绿素含量与接种时叶绿素含量的比值)表示。1.5细胞密度的测量每天定时取样用血球计数板测定细胞密度。1.6叶绿素的提取虾青素含量的测定基本按照叶勇等的方法进行。具体步骤如下:①移取10mL藻种,4000r/min离心10min,去除上清液,收集藻种。②离心后的藻种加入10mL甲醇/KOH溶液(30%甲醇和5%KOH混合液),震荡使藻种均匀分散后置于65℃的恒温水浴中加热15min,4000r/min离心15min,去除上清液。③适量蒸馏水离心洗涤1次,去除残留的碱液。④按上述步骤去除叶绿素后的藻种加入10mL二甲基亚砜,震荡使藻种分散均匀,破壁1min(100W,2s),然后置于70℃的恒温水浴中加热10min,收集上清液于490nm波长下测定光密度。计算公式:虾青素浓度C(mg/L)=4.5×OD490。1.7数据处理及分析用Sigmaplot10.0软件作图。用SPSS11.5软件分别进行单因子方差分析和多重比较(P<0.05表示差异显著)以及相关性分析。2结果2.1雨生红球藻荧光参数与细胞密度的相关性温度(5～35℃)对雨生红球藻叶绿素荧光参数的影响见图1(A～D)。单因子方差分析结果表明,整个培养周期中,温度对荧光参数Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSⅡ、ETR均有显著影响(P<0.05)。多重比较结果表明,在整个培养周期中,20℃、25℃、30℃处理组Fv/Fm、Fv/Fo无明显差异,但都明显高于其他各组。在整个培养周期中,35℃处理组的Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSⅡ、ETR下降幅度最大,与第1天相比,培养结束时,分别下降了55.47%、80.80%、70.02%、70.12%;5℃、10℃处理组的Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSⅡ、ETR虽然在接种后第1天有所下降,但是在其后的培养中变化幅度不大。表1给出了雨生红球藻的荧光参数与温度之间的相关关系。温度为5～20℃时,在整个培养周期中,雨生红球藻的Fv/Fm、Fv/Fo与温度呈极显著的正相关关系;其他荧光参数与温度的相关性与培养天数有关,培养天数为1～3d、5～10d时,ΦPSⅡ、ETR与温度呈显著的正相关关系;温度为20～35℃时,培养天数为4～10d时,雨生红球藻的荧光参数ΦPSⅡ、ETR均与温度呈极显著的负相关关系;培养天数为7～10d时,Fv/Fm、Fv/Fo与温度呈显著的负相关关系。雨生红球藻的荧光参数与细胞密度之间的相关关系见表2。由表2可以看出,各荧光参数与细胞密度的相关性与培养天数有关,培养天数为3～10d时,Fv/Fm、Fv/Fo与细胞密度呈显著的正相关关系;培养天数为4～10d时,ΦPSⅡ、ETR与细胞密度呈显著的正相关关系。2.2对20患者叶绿素相对含量和细胞密度的影响温度对雨生红球藻叶绿素相对含量及细胞密度的影响见图1(E-F)。单因子方差分析结果表明,整个培养周期中,温度对雨生红球藻叶绿素相对含量及细胞密度均有显著影响(P<0.05)。多重比较结果表明,从接种后第2天开始,20℃处理组的叶绿素相对含量和细胞密度均显著高于其它处理组(P<0.05)。雨生红球藻的叶绿素相对含量及细胞密度与温度之间的相关关系见表1,温度为5～20℃时,叶绿素相对含量及细胞密度均与温度呈显著的正相关关系;温度为20～35℃时,叶绿素相对含量及细胞密度均与温度呈显著的负相关关系。表2给出了雨生红球藻的叶绿素相对含量与细胞密度之间的相关关系,从表中可以看出,培养天数为3～10d时,雨生红球藻的叶绿素相对含量均与细胞密度呈显著的正相关关系。2.3雨生红球藻虾青素含量单因子方差分析图2给出了各温度条件下雨生红球藻的虾青素含量,其中图2-A表示单位体积虾青素含量(μg/mL),而图2-B则表示单个细胞虾青素含量(μg/cell)。单因子方差分析结果表明:温度对雨生红球藻的虾青素含量有显著影响(P<0.05)。多重比较结果表明:5℃与30℃时单个细胞中的虾青素含量均显著高于其他温度的(P<0.01),其中5℃时的略高于30℃的,但差异不显著(P>0.05)。但是单位体积虾青素含量以20℃处理组为最高。3关于雨生红球藻虾青素的发酵条件温度是决定植物代谢过程速率的主要环境因子之一。就光合作用来说,高温抑制卡尔文循环的活性,阻碍同化产物代谢,更容易影响光合电子传递,因此常用光系统Ⅱ受到的伤害作为光合作用遭受不可逆抑制的一个有效指标,如PSⅡ的光化学效率,是表明光化学反应状况的一个重要参数,它常常以Fv/Fm来表示。Fv/Fm下降被认为是植物发生光抑制的首要条件。荧光参数Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSⅡ、ETR可分别代表经过充分暗适应的植物叶片PSⅡ的最大光化学效率、PSⅡ的潜在活性、实际光能转化效率、光合电子传递效率。对许多植物品种的测定表明,Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSⅡ、ETR可作为植物逆境反应的筛选参数。图1-ABCD表明,5℃、35℃条件下,雨生红球藻的荧光参数Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSⅡ、ETR呈下降趋势,但是5℃处理组从第4天开始有所恢复,35℃处理组一直处于下降趋势,由此可以看出高低温胁迫下雨生红球藻的PSⅡ光合电子传递均受到了抑制,但是低温处理受到的抑制程度较轻于高温处理组。本实验结果表明,雨生红球藻的最适温度是20℃,此结果与殷明焱等的实验结果相一致,但与其他学者的结论有所差异,如Harker等与Borowizka等认为雨生红球藻的最适生长温度约为14～15℃,Lu等认为雨生红球藻的最适生长温度为24～28℃,当环境温度高于28℃则其生长受到抑制;Ding等认为雨生红球藻的最适生长温度为25℃;张京浦等研究认为,雨生红球藻的最适生长温度在33℃左右;苗凤萍等认为22℃与25℃有利于红球藻的营养生长。这些差异产生可能是由于培养条件的不同(例如:苗凤萍等的实验利用的是环形培养池且供给CO2,而本实验中采用的是三角瓶且不充气;张京浦等的实验所用培养基是以MCM配方为基础的,而本实验以f/2培养基配方为基础)以及品系间的差异(藻种来源及长期不同环境的驯化)所造成的,根本原因还有待进一步研究。温度对雨生红球藻虾青素的累积也有显著影响。本实验结果表明,5℃与30℃时单个细胞中的虾青素含量均显著高于其他温度组,但是由于5℃与30℃不利于雨生红球藻的生长,细胞密度显著低于20℃处理组,因此单位体积虾青素含量反而以20℃处理组为最高。由此也可以看出单位体积培养液中虾青素含量不仅与每一个藻细胞的虾青素累积量有关,而且还与单位体积中的细胞个数有关,因此在利用雨生红球藻生产虾青素时,增加细胞生物量和提高虾青素累积能力同样重要。Tjahjono等等报道30℃条件下培养雨生红球藻,虾青素含量可达到200pg/cell和20mg/L,是20℃的培养条件下的3倍。高温既提高了每个细胞中虾青素的含量,也提高了单位体积藻液中虾青素的含量。本实验表明,30℃条件下单个细胞的虾青素含量增加了,但是由于生物量的降低幅度大于虾青素含量增加的幅度,导致单位体积的虾青素含量的降低,此结果与苗凤萍等实验结果基本一致,但与Tjahjono的结果有所差异,可能是不同品系对温度变化的反应不同。目前对不同温度条件下雨生红球藻的生长和虾青素含量变化的研究已有一些报道,对其机理的探讨也在逐步深入。许多研究表明,提高温度有利于雨生红球藻中虾青素的积累,Tjahjono等认为高温促进了活性氧的产生,而活性氧最终有利于虾青素的高积累。另外也可能是较高的培养温度抑制了雨生红球藻细胞的正常分裂生长,从而使虾青素的相对含量提高。雨生红球藻虾青素积累机制的理论假设中,影响最大的是光保护学说,这一学说认为虾青素的产生是雨生红球藻对自身进行光保护的防御反应。此外,Boussiba和Vonshak认为虾青素积累的诱导总是发生在细胞分裂受到干扰时,细胞分裂速度的降低是雨生红球藻中虾青素合成的必要前提。但Lee和Ding认为,雨生红球藻中虾青素的积累只是其细胞分裂速率低于虾青素累积速率从而导致的单个细胞中虾青素绝对量增加的结果。雨生红球藻虾青素积累机制的理论还需做进一步的研究证实。传统的确定微藻适温范围的方法是测定不同温度培养条件下的细胞密度,但这种方法比较繁杂,耗时