生物传感器毕业论文设计

PAGE32南开大学本科生毕业论文（设计）中文题目：LSPR生物传感器的研究系别：电子科学与技术系专业：电子科学与技术完成日期：2010PAGE0LSPR生物传感器的研究摘要目前，基于局域表面等离子体共振(LSPR)现象的传感研究是一个热点方向，这种方法在器件开发和相关应用上均有很大的潜力。LSPR传感器具有一些优于传统SPR传感器的特性，在物理、化学和生物方面的特性测量分析上应用方便，效果显著，有很高的开发潜力。这篇文章是一个综述性的文章，首先介绍了LSPR技术目前的发展状况，对LSPR技术的原理和特点进行了归纳，并总结了目前已经成型的几种LSPR传感部件和系统的制作方法和技术要素，以及在实验中的应用领域。同时，它对基于LSPR的传感器传感芯片的未来发展趋势和商业化前景也作出了讨论。关键词局域表面等离子体共振(LSPR)；纳米粒子；生物传感器PAGE31目录摘要 01．简介 12．LSPR定义 23．LSPR与SPR的区别 44．DDA算法 65．LSPR传感系统的基本构造 75.1基于光纤的生物传感系统 75.2基于反射的光纤(RFO)传感系统 86．LSPR传感器的构造 97．LSPR传感器制作工艺 107.1基于电光调制的LSPR生物传感器的制作 107.2在玻璃表面固定金纳米棒 117.3金纳米线表面结合自组装分子 117.3.1金纳米线阵列芯片的制作 117.3.2自组装分子层结合 127.4利用NSL技术制作Ag纳米微粒 127.5银纳米结构薄膜 137.6金纳米井芯片的制作 138．LSPR传感技术的工艺方法 148.1光学系统的材料和技术 148.1.1一种匹配生物传感器的光纤探针的制作 148.1.2金纳米粒子修饰的光学纤维的制备 148.2材料表面图案加工工艺 158.2.1纳米刻蚀图案过程 158.2.2利用NSL拓展技术制作纳米孔阵 168.2.3利用μCP技术在纳米粒子层表面形成图案 179．LSPR传感器的应用实例 189.1LSPR传感器应用于测量物理量 189.1.1金纳米线阵列表面结合自组装分子的LSPR光谱测量方法 189.1.2纳米粒子表面典型消光光谱的测量 199.2LSPR传感器在化学传感领域的应用 209.2.1基于纳米Ag粒子的表面等离子体共振光谱测定CN-的测定方法 209.2.2利用LSPR传感器检测有机磷杀虫剂 209.3LSPR传感器在生物传感领域的应用 219.3.1以氯金酸氧化还原反应为基础的蛋白质病人血清样本中的葡萄糖LSPR传感探测 219.3.2使用基于LSPR的纳米芯片蛋白质的无标记监测 219.3.3使用LSPR的重组细胞蛋白质表达分析 2210．LSPR传感器技术的商业化 2311．LSPR传感器的未来发展趋势 2412．总结 25参考文献 26致谢 31一、简介近年来，纳米材料由于其独特的光学、电磁学和力学特性而得到了研究人员的广泛关注。贵金属纳米粒子显示了很强的紫外-可见光吸收带特性，绝大多数金属中都没有这种性质[1-8]。科学研究表明，贵金属纳米粒子悬浮液的这种特有性质取决于它们同光的强烈作用，而对纳米粒子光学领域的研究又使得对于材料的成分，尺寸，形状，以及局部绝缘环境和金属悬浮液的测色等等之间的关系有了更深层次的理解。对贵金属纳米粒子的光学性质的研究在理论和实践上都具有重要的意义。从理论上说，它对于系统研究纳米量级结构和引起光学性质变化的局部环境因素，以及预测结构的变化等起到了十分重要的作用。从实践上说，如果纳米结构的光学性质可调试，则它可以应用于表面增强光谱[9-13]，光学滤波器[14,15]，等离子体设备[16-19]和传感器等领域。目前局域表面等离子体共振(LSPR)的形成以及它载体上的金和银纳米粒子的光学特性都具有很大的吸引力[20,21]。金和银纳米粒子在各种纳米光学的应用，如生物芯片[22-25]，以及纳米尺度[26]方面都得到了广泛的重视和研究。被测溶液和固定在衬底表面的粒子之间的反应能够引起的生物分子层厚度的变化，而基于LSPR的检测方法就能够对这种即时变化进行检测[27,28]。我们知道，纳米粒子，如金和银，在可见光区域有强吸收作用，这就是通常所说的LSPR吸收。这种LSPR现象发生时，入射光子频率同金属纳米粒子或金属岛传导电子的整体振动相匹配。纳米量级的粒子在紫外-可见光区域表现出独特的光学响应[29,30]，它们的吸光率随着光子能量的减少呈指数衰减（被称为Mie散射），在这个区域会出现LSPR带，对于粒子材料来说，它是叠加而成的。研究显示，表面等离子体能量和强度对粒子结构和周围环境媒介等很多因素敏感[31-36]。贵金属纳米粒子由于其独特的光学特性，即它们有在普通金属的光谱中不存在的强烈等离子体共振光谱吸收带[37]，同时，基于LSPR的设备还能够与简单光学系统同时建立，这也使得对贵金属纳米粒子基于LSPR派生的各种传感器的技术研究十分热门。由于纳米材料与生物高分子、蛋白质、核酸等在尺寸大小上具有相同的量级，所以在生物医学领域，基于LSPR的各种传感器技术的研究和优化的工作也在进行之中。生物领域中的药物研究、生物传感、细胞标记、定点诊断、分子动力学研究以及载体治疗等方面的应用，都是以生物分子和纳米材料之间的相互作用为基础的。LSPR纳米传感器在检测生物分子方面应用很广泛[22,38,39]。生物传感技术被应用于大蛋白和抗体的检测。以通过NSL技术（纳米球光刻术）制得的银纳米粒子为例，当增加被吸附物层的密度和厚度时，会产生连续波长的红移。纳米粒子表面的分子的大小和密度决定波长的移动响应，表面结合的配体和溶液中的目标分子共同决定系统的检测能力。因为系统显示没有非特异性结合[22]，所以整个反应归因于分子间的配对选择。LSPR纳米传感器的性能优化可通过调整纳米粒子的大小和形状实现[32,40]。理论计算表明，纳米粒子角上的电磁场强度放大区域[40]以及整个可调传感区域，与环绕在纳米粒子周围的平均感生电磁场有关[32]。于是，随着进一步的研究成果，我们可以将纳米传感器应用于相关生物系统中来进行诊断操作，如老年痴呆症的诊断。基于LSPR技术的无标记光学生物传感器在继承了很多传统SPR传感器的优良特性的基础上，实时无标记监测分子动力学相互作用的能力也得到了进一步的发展。这种生物传感器容易制造，使用方便，只需要紫外-可见光分光计或者平板扫描仪辅助。值得注意的是，无标记光学生物传感器在基于阵列的形式下，能够方便并多元化实现高度检测生物分子之间的相互作用。二、LSPR定义LSPR现象是仅限于金属纳米粒子（有时被当作金属簇）和金属纳米结构中的传导电子共振现象[41-45]。它发生在金属纳米结构中，如纳米粒子，纳米三角形[46]，纳米岛[42]等。当光子跟金属纳米粒子中的传导电子振动相匹配时，就会产生LSPR现象。用入射波长能够激发共振的电场激励LSPR，会产生强光散射，出现强表面等离子体吸收带，同时局部电磁场增强。纳米粒子在紫外光区域表现出唯一的光学响应[30]，吸光率随着光能的减少呈指数衰减（Mie理论），出现LSPR带。表面等离子吸收带的频率、最大吸收波长和强度高度取决于材料的化学成分（金，银，铂等贵金属），纳米粒子的尺寸，分布和纳米结构形状，以及它们周围的环境[31,32,36,47]。LSPR器件制作十分容易，它不需要特殊的系统结构，如衰减全反射（ATR）光学或波导耦合器件，它可以通过利用NSL等技术达到很高的小型化程度。这些性能使基于LSPR的传感器得到了高度的关注。当入射光子频率与金属纳米粒子中的自由电子的集体振动发生共振时，会产生LSPR现象。最简单的纳米粒子光学响应模型是Mie理论，它描述长波长段球形金属颗粒的消光量。具体形式如下[37]：E其中，E(λ)为消光量，即吸收和散射光量的总和；NA是纳米粒子的局部密度；a是金属纳米球体的半径；εm是金属纳米球体周围介质的介电常数（假设为正实数，且与波长不相关）；λ是入射光波长，εi是金属纳米球体介电常数的虚部；εr是金属纳米球体介电常数的实部。容易看出，当分母中的共振项(εr+2εm)2接近零时，即达到了LSPR的共振条件。从这个最原始的模型中可以看出，掩埋于周围介电环境中的金属纳米球体颗粒的LSPR光谱特性取决于以下几个方面：纳米粒子的半径a、纳米粒子材料（εi和εr）以及纳米粒子周围介质的介电常数εm。进一步研究表明，在实际情况中，即纳米粒子不是球体时，吸收光谱将取决于纳米粒子的直径、高度和形状。在这种情况下，分母中的共振项应写作ε其中χ是形状因子项[11]，用来描述纳米粒子形貌比例。5:1的纳米粒子形貌比率所对应的χ的值从2（对于球体来说）最大可增加至17。此外，很多样品为沉积在衬底表面的纳米粒子集合。因此，LSPR还取决于粒子间距和表面绝缘常数。LSPR消光导致波长的选择性吸收并伴有极大的摩尔消光系数，大概~3×1011L/(M·cm)[48]，效率相当于106个荧光分子[51]产生的共振瑞利散射[49,50]，以及在纳米粒子表面增强的局部电磁场，这是在所有表面增强光谱中观测到强烈信号的原因，如表面增强拉曼散射(SERS)和表面增强荧光由式(1)还可以看出，贵金属纳米粒子的最大消光位置高度取决于周围环境的电介质性质，并且纳米粒子最大消光波长的移动能够被用于检测纳米粒子周围由分子引起的变化。因此，至少有4种不同的基于纳米粒子的传感机理，它们均取决于LSPR消光变化或者LSPRλmax散射强度变化。这些机理分别是：(1)来自类似于荧光染料标记的纳米粒子标记中的共振瑞利散射[39,50,51,52-57]，(2)纳米粒子聚合[58-63]，(3)纳米粒子表面电荷转移的相互作用[46,64-68]，(4)局部折射率变化[22,28,32,38,46,69-75]。三、LSPR与SPR的区别多项研究表明，基于LSPR的纳米传感器的传导机理与平面传感器的传导机理一致，是SPR传感器的拓展和延续。在近20年来，SPR传感器，利用折射率的原理来探测接合在金属表面[76]上或其附近的分析物，并且被广泛的用于检测一系列的分析物的表面接合相互作用，包括小分子的吸收[77,79,80]，配体受体结合[77,81-83]，蛋白质在自组装单层膜上面的吸收[84-86]，抗体抗原结合[87]，DNA和RNA杂交[88-91]以及蛋白质DNA的相互作用[92]。就SPR技术来说，它有三个明显的缺点：(1)SPR的共振角和共振波长的移动检测模式需要大量的光学阵列来实现[87,93,94]；(2)局限于一些平方微米量级的信号传感元的尺寸,特别典型的是10μm×10μm[95]；(3)实时性不强。比较SPR和LSPR传感器，它们非常明显的区别是折射率的灵敏度和特征电磁场的衰变波长。由于SPR传感器具有大折射率灵敏度(≈2×106nm/RIU)[79]，所以，SPR响应经常通过单位折射率的变化来体现。LSPR纳米传感器，从另一方面上说，折射率灵敏度则逊色一些(≈2×102nm/RIU)[46]。可以看出LSPR纳米传感器在这方面上比SPR传感器低了4个量级，表面上SPR传感器在灵敏度上要比LSPR传感器高10,000倍，但事实并不如此。就现阶段应用研究中所需要的灵敏度来说，两个传感器都可以很好的满足要求。特征电磁场的短的可调的衰变长度ld，可以使LSPR纳米传感器的灵敏度提高[31,32]。LSPR纳米传感器的ld大概在5-15nm或者光波长的1-3%，并且取决于尺寸，形状，以及纳米粒子的成分；SPR传感器的衰变长度大约在200-300nm或是光的波长的15-25%的。由此可见，二者在这方面具有很大的区别[79]。SPR和LSPR的最小足纹也是不同的。在实际中，SPR传感器需要至少10×10μm2的区域进行传感实验。对于LSPR传感器，这个尺寸可以通过单一纳米粒子技术最小化为大量独立的传感元件（1010个纳米粒子在一个2mm2点位上，纳米球直径=400nm）或纳米粒子（直径约为20nm）[57]。这种纳米粒子方法能够达到和SPR传感器一样的效果，由此它的像素尺寸可以减小到100nm2以下。由于更低的折射率灵敏度，LSPR纳米传感器不需要温度控制，而SPR传感器（大折射率灵敏度）需要。另外，LSPR和SPR传感器之间最值得关注的区别就是造价。已经投入商业使用的SPR设备的造价在150,000到300,000美元之间，而处于实验阶段的便携式LSPR系统的造价则少于5,由于LSPR中的消光现象是由纳米粒子对光的吸收和散射造成的，因此LSPR的实现不需要表面等离子体共振(SPR)那样庞大的实验装置。LSPR技术可以制作出体积小、系统设置简单的生物传感器，较传统的SPR生物传感器有很大的差别。但是，这两种传感器之间存在着一个相同的关系。它们的全响应都能够通过如下等式来描述[79]：Δ这里Δλmax是波长移位响应，m是折射率灵敏度，Δn是折射率由吸收引起的折射率变化量，d是有效吸收层的厚度，ld是特征电磁场的衰变长度。值得注意的是，对于平面LSPR传感器，这个等式在数值上说明了传感器上吸附物的影响。当用于LSPR纳米传感器的时候，这个指数方程不仅近似于吸收物层的响应，还对它的响应在数值上作了详细的解释[31,32]。同SPR传感器类似，LSPR纳米传感器的灵敏度取决于距离，而距离取决于来自纳米粒子表面电场的平均诱发区域。为了清晰的说明，列表总结LSPR技术与SPR技术的比较如下（表1）：表1LSPR传感器与SPR传感器的比较特性SPRLSPR无标记检测可以[78,80,89,100]可以[22,38,46,57]距离影响~1000nm[79]~30nm（尺寸可调）[31,32]折射率灵敏度2×106nm/RIU[77,79,81,97]2×102nm/RIU[31,46]模式角位差[94]，波长差，成像消光[22]，散射[39,57]，成像[39,57]温控要求需要不需要化学识别SPR-RamanLSPR-SERS场移植不可以可以商业应用开始尚未造价$150,000-$300,000$5,000（多粒子），$50,000（单粒子）空间分辨率~10×10μm[95,101]1个纳米粒子[39,57,96]非特定约束最小（取决于表面化学成分和清洗）[77,97,98,100,102]最小（取决于表面化学成分和清洗）[22]实时测量时间范围=10-1-103s，平面扩散[77,80,98,99时间范围=10-1-10多通道能力可以[93,104]可以并有研发潜力小分子灵敏性好[77]更好[31]微流体兼容性有有研发潜力四、DDA算法离散偶极近似算法(DDA)是近年发展起来的一种数值方法，原则上对任意形状及尺寸的纳米颗粒的吸收、散射及消光等光学特性进行计算。DDA算法与实验测得的紫外-可见吸收光谱的结合已成为认识纳米颗粒的结构特点及光学性质的重要手段之一，在计算光与金属纳米颗粒的相互作用方面具有较强的优势。为计算任意大小及形状的纳米颗粒的光学性质，DDA算法首先将该颗粒视为N个立方单元构成的集合体，再把每个立方单元视为电偶极子来处理[105]。任一个电偶极子与局域场的相互作用表示为（忽略频率因子eiwt）P式中αi表示单个偶极子的极化率；Eloc,i由入射光场和其他偶极子在该处所形成的偶极场两者组成E式中，E0为入射光电场的振幅，k为波矢，相互作用矩阵如下：Aj≠i在这个公式中有如下关系：k=将式(5)与(6)代入式(4)并整理可得到：α再将此式写作矩阵形式：A对于包含N个电偶极子的体系来说，P和E都是3N维矢量，A’为3N×3N的对称矩阵。解此3N复线性方程可求得极化矢量Pj，从而消光系数(包括吸收与散射两部分)可由以下方程求得[106]C以螺旋银纳米结构为例，通过DDA计算，我们可以发现这种结构可以很好的实现等离子体峰调制和电场分布排列。随着螺旋体半径的增加，主要的等离子体峰受到s偏振，右旋圆偏振，以及左旋圆偏振入射的影响而发生红移。即使不改变结构，通过把入射光从左旋圆偏振改变为右旋圆偏振，等离子体峰也能够实现可调。除此之外，最大电场的空间分布可以通过改变入射光的偏振方向来调节：对于位于主要的等离子体峰波长的s偏振光来说，最大电场分布在螺旋横截面附近，或者接近螺旋中轴线，这是由于强耦合作用形成的；而对于圆偏振光，根据入射方向，最大电场会位于螺旋的顶端或者底部。所以，对于传感和分析领域来说，通过使用不同的入射偏振，我们可以从空间上断定被分析物在螺旋中的位置。因此，我们可以获得空间分辨的被分析物信息。在实际中，它可以在亚微米量级内判定被分析物的空间分布情况。5．LSPR传感系统的基本构造5.1基于光纤的生物传感系统如图1所示这个系统包括一个激光器(HitachiHL6320Glaserdiode,635nm,10mW;ThorlabsLDC500laserdiodecontroller;ThorlabsTEC2000temperaturecontroller;ThorlabsTCLDM9lasermount)，一个斩波器(StanfordResearchSR540)，一个光纤耦合器，一条传感光纤，一个样液池(10mL)，一个光接收器(ThorlabsPDA55)，一个锁相放大器(StanfordResearchSR830)。将乙酰胆碱(ACh)溶液放入样液池中，并使LSPR传感器水平放置。在达到平衡后，在容器中放入特定量的对氧磷，60秒后会产生一个新的稳定响应，它们之间的反应可在2到4分钟内测量。图1LSPR生物传感器系统的示意图5.2基于反射的光纤(RFO)传感系统RFO对于高压的构造如图2所示。这个系统由一个激光器(HitachiHL6320Glaserdiode,635nm,10mW;ThorlabsLDC500laserdiodecontroller;ThorlabsTEC2000temperaturecontroller;ThorlabsTCLDM9lasermount)，一个斩波器(StanfordResearchSR540)，一个分光器，一个锁相放大器(StanfordResearchSR830)，以及一个图片接收器(ThorlabsPDA55)组成。图2的放大部表示没有覆盖的光纤穿过一个1/16英寸的PEEKTM联合管套筒。PEEKTM联合接线至一个热控制的高压室中，接线管为1/4英尺长，0.065英尺厚的不绣钢高压管，在450K下可以承受高达70MPa。高压室的温度通过循环水浴(Wisdom,modelLC-06)保持误差在±0.05K内。在高压室中使用镍镉-镍铝热电偶(ThermocoaxeTypeK)测量待测液样温度，热电偶通过铂温度计(Guildline,model9540)校准。温度测量的精确度在±0.01K之内。压力测量使用仪器为精确度在±0.05MPa内的50.4MPa的压力变换器(Sensotec,modelAG-300)。高压源容器用来供给超临界二氧化碳(SCCO2)，高压液体泵(ShimadzuLC-8A)把被分析溶液压入高压室。每个测量至少重复5次。测量受体单位浓度时，归一化强度会发生变化，从而可以确定金纳米粒子修饰的LSPR光纤传感器的灵敏度。图2高压条件下基于反射的光纤传感系统示意图6．LSPR传感器的构造目前出现的各种新型的，把生物识别反应转换成放大的光电信号的设备的基础是纳米金和银粒子所产生的局域表面等离子体共振光谱及其电学性质。T.Schalkhammer[107]曾详细地论证了1个金属镜面上能够结合聚合物隔离层、生物反应层和与生物识别相结合的纳米金属簇，借助于簇与镜面偶极分子之间的相互作用(连接或解离)，通过产生的共振增强光谱从而转换成清晰可检测的光学信号，如图3所示。图3放大了的金属簇光学生物传感器组成图4所示的是基于电光调制的LSPR生物传感器，左上图为该生物传感器的实物照片，右上图为该生物传感器的截面示意图。这种LSPR生物传感器的设备结构制作在x-剖面，y-方向的LiNbO3上，这种材料具有优异的电光效应。这种生物传感器由一对电极，钛扩散的波导，以及涂覆了人血清白蛋白(HSA)的金纳米粒子的传感区域组成。在共面电极上加电压可以使电场沿Z方向传播，这样就可以通过电光系数r13来调制折射率。图4基于电光调制的LSPR生物传感器的设备结构7．LSPR传感器制作工艺7.1基于电光调制的LSPR生物传感器的制作1020°C下在衬底上扩散20nm厚的条形钛，整个过程持续6小时，就可形成波导。利用光刻和热蒸发技术制成300nm厚的带有电极的铝膜，电极间距分别为40，60和80μm，对应波导宽度分别是20,40和60μm。为了防止电极由于液体分析物的增加而短路，在衬底的传感区域上沉积一个4nm长，300nm厚的SiO2开口层。向沸腾的HAuCl4溶液中加入柠檬酸钠即可制取金纳米粒子，粒子直径的平均值是22.64nm，标准差是2.32nm。为了在LiNbO3上固定金纳米粒子，使用羟基团和3氨丙基三甲氧基硅烷对衬底表面的末端分子进行化学修饰。金纳米粒子通过光刻和旋涂选择性沉积在表面上。把经过化学修饰的表面[108]浸泡在HSA的磷酸二氢钠溶液中，就可使HSA在纳米粒子表面自合成。完整的LSPR生物传感器如图4所示。被分析物为β阻滞剂（心得舒），它可以按照1:9配置乙腈和去离子水溶液制取。7.2在玻璃表面固定金纳米棒80°C下，用RBS洗涤剂清洗玻璃衬底，并使用超声波降解标本10分钟。在用水冲洗干净后，把载玻片放在1:1的甲醇/盐酸溶液中，超声波降解30分钟后，再一次用大量水冲洗，然后使用乙醇冲洗。接下来，将载玻片置于烤箱中在60°C下进行烘干，烘干过程大概需要12小时。在冷却后，将载玻片放在10%的巯丙基三乙氧基硅烷(MPTES)的乙醇溶液中反应15分钟，使玻璃表面形成硫基硅烷自组装单层膜(SAM)结构。将这些经过处理的载玻片在乙醇中彻底清洗并再一次使用超声波降解（每一个载玻片持续5分钟）。最后，把载玻片放入烤箱，保持温度为120°C，烘干过程持续3小时[69,109,110]金纳米粒子棒固定在硫基硅烷SAM的玻璃表面上之前，要进行精密离心过滤过程，去除金纳米棒悬浮液中多余的溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)。悬浮液均匀分布在三个管中并在4500rpm下进行30分钟离心（Beckman模式J21-21离心机，配有JS-13.1旋转器），过滤掉一半悬浮物。将纳米棒悬浮液重新悬浮，同时将每个试管中的溶液稀释为30mL，再次离心，过滤所有悬浮物。接下来，将每个试管中的纳米棒悬浮液再次稀释至30mL并悬浮，再一次离心。在过滤悬浮物后，金纳米棒会互相组合，最终可以得到总体积为75mL的水悬浮液，将经过修饰的硫基硅烷玻璃载玻片置于此悬浮液中，约12小时后，即可完成金棒芯片的制备。7.3金纳米线表面结合自组装分子7.3.1金纳米线阵列芯片的制作在硅基板上旋涂浓度为1.25%的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)溶液，膜厚约50nm，在150°C下烘烤半小时，去除水气并使PMMA排列定型。使用原子力显微镜(AFM)(Smena-HV,NT-MDT,Russia)进行纳米压印，力学常数为40N/m，探针针尖直径约20nm(NSC15,MikroMasch,Russia)。这个过程主要是在铺有PMMA的硅基板上刻划出纳米凹槽后，用电子枪蒸镀系统。蒸镀时，要先蒸镀厚度约为1nm的钛层，再蒸镀厚度为20nm的金层。制作过程中还要辅助剥离与清洗过程。最后，可以得到线宽小于100nm金纳米线阵列，流程示意图如图5所示图5金纳米阵列制作流程示意图7.3.2自组装分子层结合在室温下，把制作好的金纳米线阵列芯片浸入浓度为10-3M的十八烷硫醇(ODT)酒精溶液中，经过一段特定时间后取出芯片，立即用酒精清洗并用氮气枪吹干。最后，在空气中用加热板在100°C下烘烤约10分钟，确保残留在芯片上的水分完全去除，进而可以得到表面7.4利用NSL技术制作Ag纳米微粒纳米球光刻术(NSL)是一种纳米加工制造技术。利用这种技术能够控制表面限定的纳米微粒的形状、尺寸和结构（见图6）。利用这种技术合成面宽约为100nm，高为500nm的Ag纳米三角形微粒，并采用LSPR光谱测量法测量微粒的光学特性。纳米微粒的消光波长极大值随吸附物质发生位移，导致靠近纳米微粒表面处的局部反射发生改变。为制备生物传感用LSPR纳米传感器，首先用自组装单层膜使Ag纳米三角形微粒具备吸附功能；其次利用零长度耦合试剂将生物素共价连接吸附到羧基上。如图6所示，Ag纳米微粒的制作步骤如下：(1)清洁基片；(2)将单一溶剂聚苯乙烯纳米球滴落覆盖在基片上；(3)烘干六边紧密填充的纳米球单层膜，形成纳米球掩模；(4)Ag蒸发沉积在样品上；(5)在乙醇中进行超声波降解去除纳米球掩模；(6)制备出Ag纳米微粒样品。图6银纳米微粒的NSL加工工序7.5银纳米结构薄膜目前，出现了一种新颖的制作银纳米结构薄膜的方法，在制作过程中，反应溅射AgOx薄膜量较之以往减少了[110,111]。这种方法具有如下优点：(1)可以在圆片级区域上制作均匀的银纳米结构薄膜；(2)不需要额外加热；(3)AgOx的还原所需时间短。这些优点使得这种方法不单适用于批量生产银纳米薄膜，而且适用于制作低成本的LSPR传感芯片。银纳米薄膜在LSPR生物传感器方面的应用具有很大的潜力，它可以用于检测生物素和链酶亲和素分子间的反应。通过反应离子刻蚀(RIE)还原AgOx薄膜可以制取银粒子的纳米结构薄膜[111,112]。在总压强为0.5Pa的氩氧混合气体（40%氩气，60%氧气）中对纯银靶(99.99%)进行反应射频磁控溅射，经过抛光的硅晶片上（尺寸为10×10mm2）可沉积一层厚度为50nm的AgOx薄膜。然后AgOx通过两个RIE刻蚀过程被还原为Ag。第一个刻蚀过程在CF4(2sccm)，H2(30sccm)和O2(10sccm)的混合气流中进行，整个过程持续1分30秒；第二个刻蚀过程在H2(30sccm)和O2(10sccm)的混合气流中进行，整个过程持续8分钟。第一个刻蚀过程让银纳米粒子成核，而第二个刻蚀过程是核的生长过程。7.6金纳米井芯片的制作在金纳米岛芯片上旋涂（在500rpm下持续5秒钟，然后在1500rpm下持续30秒）SU-8100(Microchem,USA)，涂层厚度为200μm，然后在95°C下前烘100分钟。在波长为365nm处进行紫外曝光（每次能量密度为630mJ/cm2），可以形成一个8×8的井(Φ=800μm)阵列图案。在曝光后，在95°C下进行30分钟后烘，然后将其置于SU-8显影液中，进行3分钟弱超声处理，就可以去除井区域不交联的SU-8树脂并使部分井中的金纳米岛表面曝光。图7为金向金纳米岛芯片表面的井中放入0.2μL不同含量GST-hIL6细胞裂解液，然后将井芯片在25°C下放置在密闭的培养皿中，以防止样品溶液蒸发。然后将芯片用磷酸盐缓冲溶液(PBS)和去离子图7金纳米岛井芯片的制作过程原理图8．LSPR传感技术的工艺方法8.1光学系统的材料和技术8.1.1一种匹配生物传感器的光纤探针的制作把多模态光纤(G50/1253002,FujikuraLtd.,Japan)新切割的端面放在N-s2-氨基乙基3-氨基丙基-三甲氧基硅烷(SILAACES320,ChissoCorp.,Japan)(50mM)的乙醇溶液及5%的乙酸溶液中，在室温下浸泡十分钟。用乙醇冲洗光纤，然后放在烤箱里，在120°C下进行硅烷化。在此之后，把光纤浸泡在金纳米粒子的水溶液中。一段时间后金纳米粒子就被固定在光纤的端面上。由于金纳米粒子有超过80%的重现性，因此这个过程大概产生约20%的覆盖范围，这对于目前的用途来说是足够的。8.1.2金纳米粒子修饰的光学纤维的制备多模态塑复合二氧化硅光学纤维(modelF-MBC)（从Newport(Irvine,CA)购买）芯直径为400μm，包层直径为430μm。在样液池中以3:7混合过氧化氢(浓度30%)和浓硫酸，光纤裸露部分(~2cm)在此混合液中清洗30分钟。清洗过后，将光纤裸露部分浸泡在1%MPTMS的甲苯溶液中。8个小时后，取出光纤并用甲醇清洗，去除表面的多余单体。在经过彻底清洗之后，把光纤裸露部分放入吸光率大概为1的金溶胶中。经过5小时后，在芯表面上可以形成自合成金纳米粒子单层。随后，经过修饰的光纤要依次用水，甲醇和三氯甲烷冲洗。8.2材料表面图案加工工艺8.2.1纳米刻蚀图案过程纳米刻蚀图案过程如图8所示。首先沉积一层金属铬薄层(2nm)增强金层同衬底的黏合。接下来，通过电子束蒸发技术在玻璃衬底上沉积厚度为40nm的金层，并在金薄膜上旋涂不同浓度的聚苯乙烯(PS)溶液（质量分数分别为1.5，0.8，0.5%，PS的分子量为45,730)。聚合薄膜在玻璃过渡温度Tg以上退火并且选用预先设定的混合PDMS模式刻蚀。刻蚀过程在真空中150°C，1.60kPa低压下进行，持续30分钟到1小时。图8中，方案A适合高PS浓度，由于PS膜足够厚，所以可填充在PDMS和衬底之间的圆柱孔；方案B适合低PS浓度，质量分数在0.8%之下，由于PS膜很薄，所以对于缝隙只能部分填充。PS薄膜在毛细管力的作用下延PS壁上升并且在壁周围形成环形波动。PS图案经过CF4/O2的RIE处理后，可以去除衬底表面多余PS层。RIE过程改进了PS图案的形体尺寸。在冷却到室温后，用氩离子粉末掩模2分钟，使PS图案位于金阵列图案的后面。离子刻蚀的直流偏置是400V，同时要保持氩气压在5×10-4Torr以下。注意，带有波浪边缘的薄环形PS点最后制成的金环图案如图8B所示。最后，使用超声波在甲苯中降解衬底15分钟去除残余PS掩模。我们使用氨基烷链硫醇(AUT)的SAM对金岛表面进行修饰，如图8的C部分所示。为了保证经过AUT修饰的SAM在金岛上能够良好生长，我们先将样品放在AUT溶液中，经过24小时后，彻底冲洗并在纯氮气中吹干。然后使用含有10mM双磺基琥珀酰亚胺辛二酸酯(BS3)的PBS溶液活化金图案阵列。然后，把衬底放在质量分数为10%的端氨基聚酰胺-胺(PAMAM)G4树状大分子的甲醇溶液中，锚定的PAMAM会同活化生物素sulfo-NHS-LC-biotin共价结合形成胺基键。把经过生物素修饰的金点和环阵列放在20μM的链霉亲和素(SA)溶液中曝光，从而诱发SA结合在经过生物素修饰的金表面上。用带有单色仪双光束系统的紫外-可见近红外光谱仪(JASCO:V-570)测量LSPR，扫描波长分布在300到2500nm区域内，光源是非偏振的卤钨灯(200~2500nm)。在介质中，我们使用AFM(SeikoInstruments:SPA400)在接触模式下拍摄纳米阵列的图像。在图8中，A,B分别表示利用厚和薄的PS膜形成点和环图案。C表示利用端氨基PAMAM树状大分子的SAM作为中间耦合层在金图案上固定SA蛋白质的过程。在这个过程中，我们使用活化生物素Sulfo-NHS-LC-biotin交联SA蛋白质。图8压印光刻和离子刻蚀制作金岛纳米图案示意图8.2.2利用NSL拓展技术制作纳米孔阵首先要对衬底（熔融石英，25mm×25mm×1.5mm）进行化学处理使其表面具有亲水性。将衬底浸在硫酸/过氧化氢为3:1的溶液中，最少持续2小时。然后将衬底在超纯水中清洗，接下来将其置于超纯水溶液/氢氧化铵/30%过氧化氢为5:1:1的溶液中并使用超声波作用持续1小时。最后，衬底在超纯水中彻底清洗并且置于超纯水中保存，待使用时再从水中取出，60°C下在空气中被烘干。接下来，将新制备的超纯水滴落在衬底上并使其扩散，所需水量取决于胶体溶液的浓度和所用纳米球的直径。胶体纳米球溶液（直径390nm，4%的固体来自于DukeScientificCorps）最初为团状，浮在水膜上，所以要对它进行扩散处理，使其浓度在衬底表面各处均匀分布。然后，把样品放入烤箱中，在60°C下烘干，烘干过程持续1小时。由于水气蒸发，纳米球自合成为六边形紧密堆积的单层阵列，可以作为光刻掩模。最后，要在纳米阵列中热蒸发银。在二氯甲烷中使用超声波作用去除纳米球后，留下来的即为三角形银纳米粒子阵列。若要利用此技术制作更大的纳米粒子阵列和纳米孔阵，在蒸发银之前要使用氧等离子体对纳米球进行反应离子刻蚀。Haginoya等人首先使用了这个附加步骤，利用在经过刻蚀的纳米球阵列区域蒸发铂钯抗蚀剂，他们成功地制取到硅孔阵[113]。如果把刻蚀时间从50s增加到120s，纳米球的直径就会减少，这就导致样品的金属纳米粒子尺寸持续增加，最后合并成与纳米粒子阵列相同周期的孔阵。概括说来，整个过程如图9所示，其各部分小图示意如下：(1)滴落移液管中的胶体溶液；(2)纳米球随着液体的蒸发而排序；(3)银蒸发在非酸蚀（左）和酸蚀（右）的纳米球阵列上；(4)纳米球被移除之前的俯视图；(5)在纳米球被去除后形成的离子阵列（左）和孔洞（阵列）。图9制作过程示意图8.2.3利用μCP技术在纳米粒子层表面形成图案微接触印刷技术(μCP)是一种多功能技术，它使得在微米和微米以下量级结构的表面图案的产生变得容易(XiaandWhitesides,1998)。对于复杂的纳米粒子层结构，首先使用乙醇清洗金包层硅晶片和弹性聚二甲基硅氧烷(PDMS)图案，然后把它们用氮气流中吹干。接下来，在含有1mM十八硫醇(C18)的乙醇溶液中印刷图案。1分钟后，图案用氮气风干并且轻轻的压在晶片上。2分钟后，撤去图案，用乙醇冲洗衬底并在氮气流中烘干。把裸露的表面区域在新制备的10mM巯基乙酸盐(TG)的微孔水溶液中曝光。经过1小时后，表面用微孔水清洗干净并用氮气吹干。向粒子层表面滴落一层由350nm的PS粒子组成的粒子悬浮液。微孔水、EDC/PBS溶液（100mL的PBS中，1-乙基-3-(3-(二甲基氨)丙基)碳化二亚胺(EDC)的质量是1.25-2.50mg）的体积比是2:1:4。持续1小时曝光之后，用微孔水轻轻冲洗衬底并在氮气流中风干。纳米粒子仅仅被TG覆盖的区域吸收。然后，采用与同性表面相同的处理方法对其金属化即可。注意，这个方法与Kaltenpoth等人于2003年提出的方法不同，因为这里的胶状纳米粒子是在吸收之前形成的。9．LSPR传感器的应用实例9.1LSPR传感器应用于测量物理量9.1.1金纳米线阵列表面结合自组装分子的LSPR光谱测量方法将原始金属纳米线阵列与之后浸过ODT溶液的金属纳米线阵列分别在暗室中进行LSPR散射光谱测量。使用100W的卤素灯(Olympus,BX51M,Japan)作为光学显微镜的光源。在暗视野下，用白光照射制作好的芯片，通过光纤接收金属钠米线阵列散射出来的光，并将此散射光导入单色光谱仪中(CVI,DK240,U.S.A)，然后使用光电倍增管(CVI,AD110,U.S.A)放大接收光信号，再将此放大信号送到电脑中，经过软件CVIAD110处理后即可得到金属LSPR散射光光谱。最后使用CCD相机拍摄光学显微镜暗视野模式下金纳米线阵列的光学影像。光谱测量仪器结构如图10所示。图10光谱测量仪器结构示意图9.1.2纳米粒子表面典型消光光谱的测量工作在反射模式的光纤结构可以测定纳米粒子层的某些性质，如图11所示。用光谱分布在190到1700nm的氚钨卤素光源(DH2000,OceanOptics,Dunedin,FL,USA)通过光纤照射样品表面，并用另一个光纤收集从表面反射回来的光，再用带有二极管阵列的微型光谱仪(HR2000,OceanOptics)在200到1100nm的光谱范围内进行分析。根据测量对横向分辨率的要求，两个光纤分别被用作照明和检测。对于光斑直径约3mm左右的大尺寸的测量，我们使用普通光纤反射探针(R200-7,OceanOptics)，如图11a所示。在高分辨率实验的情况下，横向分辨率减少至5μm，这时使用如图11b所示的检测光学方法。在这种情况下，用带有纤维束的大功率卤素光源(Fiber-Lite190,Dolan-Jenner,Boxborough,MA,USA)取代氘钨卤素光源。这样可以保证足够高的光子通量，满足每个光斑以及样品表面的扫描达到足够的收集量。来自表面的反射光利用光学系统在50μm长的多模光纤的端面成像。光学系统主要由一个显微镜物镜(MSPlan20,OlympusDeutschland,Hamburg,Germany)和一个相当于目镜的凸透镜（焦距为50mm）组成，横向分辨率为5μm。若要实现高分辨率模式下样品的自动扫描，可以自行设计基于VisualBasic的软件，它可以实时控制两个步进电机（分辨率0.5μ图11各部分具体示意如下：图11a表示自动光谱分辨测量的普通结构，这里使用的反射探针横向分辨率大约为3mm。图11b表示用于高横向分辨率表面的光学探针。为了获得高通量，使用光纤束取代反射探针，探测过程通过透镜系统在多模光纤端面的成像完成。图11在紫外-可见-近红外区域测定金纳米粒子层反射率和消光光谱的光学系统9.2LSPR传感器在化学传感领域的应用9.2.1基于纳米Ag粒子的表面等离子体共振光谱测定CN-的测定方法向容积为25mL的比色管中，加入一定浓度CN-试样溶液和体积为15mL密度为10μg/mL的胶体银溶液。在剧烈震荡后，把混合溶液稀释至25mL（保持溶液NaOH浓度为0.015%(m/v)）。接下来，向溶液通氧3分钟。然后用1cm石英比色皿、以水作参考，比较测定溶液于399nm处的吸光度值，由工作曲线求出CN-浓度。9.2.2利用LSPR传感器检测有机磷杀虫剂液相和气相色谱分析是检测有机磷杀虫剂的常用方法，但是这些方法需要很长时间，并且需要进行繁琐的样品预处理。这里介绍的方法是使用金纳米粒子同乙酰胆碱酯酶(AChE)共价耦合的LSPR生物传感器来检测对氧磷样品。将经过AChE修饰的LSPR传感器浸泡在0.05mM的ACh溶液中，可以检测的范围是1~100ppb，它具有高灵敏度和稳定性等特点。ACh和AChE的反应通过破坏AChE丝氨酸中的氢氧键进行。经过ACh修饰的LSPR传感器（在PH为8.5的12.5mU/ml的AChE的磷酸缓冲液中在室温下浸泡14小时）具有最好的线性响应。传感器表面产生14%的抑制作用，这相当于让对氧磷浓度在1到100pp范围内发生改变。传感器在500ppb对磷酸的条件下经过6个循环后，可以保留原有活性的94%，它可以通过0.5mM的2-PAM再生。此外，传感器在4°C9.3LSPR传感器在生物传感领域的应用9.3.1以氯金酸氧化还原反应为基础的蛋白质病人血清样本中的葡萄糖LSPR传感探测HAuCl4与葡萄糖在碱性介质中经过热激活氧化还原反应可以形成金纳米粒子结构，它可以通过测量等离子体共振吸收，LSPR，以及透射电镜(TEM)图像来进行分析判定，因为金纳米粒子的结构可显示特有的等离子体共振吸收带和相应的LSPR信号。研究结果发现，使用普通荧光分光计可以方便的探测到产生的LSPR信号。随着葡萄糖浓度增加，LSPR的强度同在2.0到250.0μmol/L范围内葡萄糖的含量成线性响应。这是一种新的葡萄糖检测方法，它的探测极限是0.21μmol/L，并且在糖尿病患者的血清样本中可以很容易地进行这种葡萄糖检测。研究表明反应的活化能是34.8kJ/mol，摩尔比率为3:2。在容积为10.0ml的摇瓶中分别加入1.0mL的BR缓冲液(pH值11.20)，1.0ml浓度为2.0mmol/L的HAuCl4溶液，适当体积的葡萄糖溶液以及10.0μL尺寸为10nm的金纳米粒子(1/10,000)。均匀混合这些溶液，并将溶液均匀稀释到所需浓度。接下来，将此混合溶液在373K的温度下放置5分钟，然后冷却到室温。在200到700nm区域内（即Δλ=0）同时扫描F-4500荧光分光计的激励波长和辐射波长，即可获得LSPR光谱。测量过程中，荧光分光计的激励和辐射的狭缝宽度是5.0nm。因此，选择420nm作为吸收和散射光谱的起始位置可以更加清晰的观察到结果光谱的红移。9.3.2使用基于LSPR的纳米芯片蛋白质的无标记监测在抗体固定在多组芯片上之后，利用纳升调剂系统将不同浓度的抗原溶液（从0到100μg/mL）导入到300个点位上，静置30分钟（图12）。注意，在这个过程中，总样品的体积在减少，不同的点位上对应的100nL抗原样品溶液的浓度不同。点位上的反应要持续30分钟。接下来，立刻用1%的Tween-20溶液冲洗，这样可以抑制非特异性吸收。我们可以计算得到芯片的光学特性。在室温下，整个吸收光谱从400-800nm在紫外-可见光分光计上排列。光纤束中的白光沿垂直方向入射到纳米芯片上。反射光被耦合入光纤束的光纤探针，它可以通过紫外-可见光分光计进行分析。从纳米芯片表面获得的数值结果表明特异吸收强度的改变直接由在点位上所使用的抗原浓度决定。图12：基于LSPR的多组纳米芯片的实验设备9.3.3使用LSPR的重组细胞蛋白质表达分析金纳米岛薄膜的平均厚度为73nm。它的制备主要是利用电子束蒸发低沉积率的金膜，然后对已使用硫醇处理过的玻璃基底进行热处理。金纳米岛芯片可以作为无标记光学传感器。金纳米岛基于LSPR技术并被修饰为亲和表面，可以用于检测蛋白质分子层。在浓度低至30ng/ml的生物素与金纳米岛表面结合的链霉亲和素(STA)层可以通过正常的传导光谱测量。通过ATR图像测量，我们通过金纳米岛井芯片证明了重组细胞谷胱甘肽s-转移酶(GST)和人白细胞介素6(hIL6)之间的反应，在不同稀释程度的原生细胞溶解产物可以直接分析出来，它可以分析1.3ng/井的蛋白质和没有经过提纯的蛋白质。具有ATR图像测量功能的金纳米岛芯片可以作为一种简单有效的生物传感器，它可以应用在多重筛选的重组蛋白质中。下面使用生物素对金纳米岛表面进行修饰。室温下，把金纳米岛在含有0.1mM生物素-HPDP的纯乙醇溶液中搁置4小时，表面即可形成生物素-HPDP(Pierce,USA)的自组装单层膜。接下来将金纳米岛芯片清洗干净并风干。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)（pH值为7.4）将链霉亲和素稀释为不同的STA溶液浓度。在经过生物素修饰的金纳米岛芯片上滴落100μL的STA溶液，为了避免溶液蒸发，要将芯片置于密闭的培养皿中。在25°C下放置3小时后，芯片用PBS冲洗5次。STA分子束缚在经过生物素修饰的芯片表面上，这导致金纳米岛光谱发生改变，使用DU800分光光度计即可10．LSPR传感器技术的商业化多项研究结果表明，基于LSPR的光纤生物传感器，可不使用ATR光学技术，它的灵敏度能够达到微米量级以内。这种传感器建立在光学纤维的端面上，具有如下优点：(1)容易操作；(2)可以探测小量样品如蛋白质溶液。这种生物传感器对于折射率的灵敏度很高，大约是在2×10−5RIU左右，类似于传统的SPR传感器。对贵金属纳米粒子的LSPR传感器进行实验研究后发现，这类传感器显示了很大的潜力。以金纳米棒传感器为例，它具有如下两个特点：(1)这种传感器能够利用非光刻方法实现重复制造，即临床诊断中所需成本能够大幅降低；(2)它的测量方法主要基于光谱的移动，而如果非特异性结合被减为最小，基于LSPR波长的传感器在血清中的探测极限可以达到皮摩尔量级。医学报告显示，牛奶过敏症目前已经成为对当今社会人类健康危害程度很大的一种疾病，它的症状表现为呼吸困难，并伴有皮疹以及腹痛出现，而孩童为这种病症的高发人群。经过实验发现，金纳米粒子的LSPR免疫传感器可以检测牛奶样品中的酪蛋白过敏原。因此，这种检测设备不仅在医用过敏诊断中具有很大的作用，基于LSPR的生物传感器还有可能发展成为高集成的食物安全监控系统。基于LSPR的传感器制作方法和建立的光学系统均十分简单，成本比SPR和ELISA系统要低很多。所以我们可以预见，如果这一技术得以投入市场应用，它必将具有很高的商业价值。综上所述，基于LSPR技术的传感器与传统SPR传感器的作用相当，而它的性价比却有超出SPR传感器的趋势。LSPR传感器的灵敏度和探测极限高，系统结构简单，集成度高，制作工艺简单，操作方便，而在造价和成本上却远远低于传统的SPR传感器。因此，可以预见的是，基于LSPR的传感器在医疗诊断，实时探测等方面将会具有很广阔的商业化前景，它代表着传感器向便携式和简单化发展的一个方向。11．LSPR传感器的未来发展趋势功能化的纳米金和银粒子的增强作用，因纳米材料固有的小尺寸效应、表面效应和量子尺寸效应等使其呈现出独特的光学和电学性质。同时金纳米粒子具有良好的生物兼容性，易同DNA分子杂交结合。所有这些性质构成了它们在分子生物学、临床医学和生物芯片中应用的基础，同时也为DNA计算机的开发带来了光明的前景，因此它们也是生命科学中分析化学研究的重要组成部分和当今发展的重点领域。诊断学中未来的发展方向将会继续追求纳米量级的生物芯片技术的小型化。基于LSPR的多通道纳米芯片可以方便地实现在并行结构下生物分子相互作用的特定高灵敏度无标记方法探测，而且成本十分低廉。在透射或反射几何配置的无偏振、紫外-可见消光光谱等测量的应用中，LSPR纳米传感器配套设备体积小、重量轻、坚固耐用、成本低廉、方便携带，而操作方法即使非专业人员也容易掌握并实践。值得注意的是，基于LSPR的纳米芯片的造价，包括光学仪器的造价，要比常规SPR系统低廉。这种技术将拓展当前分子诊断学和尖端诊断学的极限并促进人体用药物的发展。生物传感应用的多通道潜力使得生物标记研究，癌症诊断，以及传染微生物免疫抗体检测具有最优化的潜力。基于LSPR的多通道纳米芯片实现了检测方法的高通用性，它可以应用于其它种类的生物鉴定，如在代谢组学和细胞组学中的应用。在选择性和灵敏度方面的进一步改进后，LSPR生物传感器很有可能取代传统方法成为一种新的经济的探测工具，在现场测量和医疗诊断等方面具有很好的应用前景。放眼未来，我们期待这种方法可以成为攻克各种复杂病症的重要工具，如老年痴呆症等。金纳米粒子的SPR散射和吸收经过强烈放大后，能够用于生物和细胞成像为基础的癌症诊断以及光热转换的癌症治疗中，这是一种新颖且十分有效的方法[114-119]。利用人工手段合成纳米粒子与靶项受体在癌细胞上过度表达的抗体，从而可实现分子特定成像和癌症治疗[114,115,117-119]。通过利用适当的靶项策略，这种成像或治疗方法能够适用于多种癌症以及其他的疾病。尽管免疫导向金纳米粒子在癌症成像与治疗中的最初尝试性应用获得了成功，这种方法依然有很多因素需要进一步的优化。优化的主要方面有纳米粒子吸收和散射的截面，靶项抗体同纳米粒子的结合，以及纳米粒子生物复合的靶位点。尽管很多研究都是针对单层细胞展开，但是在实际应用中还需要对纳米粒子药物代谢动力学上的研究，包括血流量，渗透行为，肿瘤扩散，生理反应，纳米粒子的稳定性，等等[120-123]。并且，还有必要研究这些因素对纳米粒子的尺寸，表面化学作用，以及传输模式的依赖性。还有，将近红外光施加到不同癌症的感染细胞上的最有效方法也需要进一步的研究。纳米粒子辅助光热调制装置对细胞的损害也并没有完全的解释，依然需要进一步的研究。在所有这些方面的系统研究是等离子体纳米粒子在癌症探测和选择性光热调制治疗医用设备中的成功应用的前提条件。12．总结近年来，LSPR技术由于其独特的性质得到了广泛的关注和研究。这篇论文综述了LSPR技术的发展状况并且讨论了以此技术为基础的传感器的应用和测试。总体说来，通过LSPR传感器在各领域如物理，化学，生物方面对于小量分子或高灵敏度物质的探测，我们可以得知LSPR技术具有相当大的潜力。同时，通过LSPR为基础的器件的研究和开发，以及在实验方面所尝试的应用实例的介绍，我们可以想象，LSPR技术以及基于LSPR的生物传感器技术将会极大地促进相关领域的监测学和诊断学的发展。由于基于LSPR技术的各类传感器和传感芯片所需配合仪器便于携带，操作简单，成本低廉，而灵敏度却很高，可以预见的是，这种传感技术将会具有相当可观的商业前景，而对于其的后续研究和改进完善工作也是十分必要的。对于LSPR技术及其相关传感技术的研究存在着深远的意义。

参考文献[1]HaynesC.L.,andVanDuyneR.P.:‘NanosphereLithography:AVersatileNanofabricationToolforStudiesofSize-DependentNanoparticleOptics’,J.Phys.Chem.B,2001,105,5599~5611[2]MulvaneyP.:‘Notallthat’sgolddoesglitter’,MRSBull.,2001,26,1009~1014[3]El-SayedM.A.:‘SomeInterestingPropertiesofMetalsConfinedinTimeandNanometerSpaceofDifferentShapes’,AccountsChem.Res.,2001,34,257~264[4]LinkS.,andEl-SayedM.A.:‘SpectralPropertiesandRelaxationDynamicsofSurfacePlasmonElectronicOscillationsinGoldandSilverNano-dotsandNano-rods’,J.Phys.Chem.B,1999,103,8410~8426[5]KreibigU.,GartzM.,HilgerA.,metalclusters’,inDuncan,M.A.(ed.):‘AdvancesinMetalandSemiconductorClusters’(JAIPressInc.,Stamford,,1998),Vol.4,345~393[6]MulvaneyP.:‘SurfacePlasmonSpectroscopyofNanosizedMetalParticles’,Langmuir,1996,12,788~800[7]Kreibig‘HandbookofOpticalProperties’(CRCPress,BocaRatonFL,1997),Vol.II,145~190[8]HulteenJ.C.,TreichelD.A.,SmithM.T.,etal.:‘NanosphereLithography:Size-TunableSilverNanoparticleandSurfaceClusterArrays’,J.Phys.Chem.B,1999,103,3854~3863[9]FreemanR.G.,GrabarK.C.,AllisonK.J.,etal.:‘Self-AssembledMetalColloidMonolayers:AnApproachtoSERSSubstrates’,Science,1995,267,1629~1632[10]KahlM.,VogesE.,KostrewaS.,etal.:‘PeriodicallystructuredmetallicsubstratesforSERS’,Sens.ActuatorsB,Chem.,1998,51,285~291[11]SchatzG.C.,andVanDuyneR.P.:‘ElectromagneticMechanismofSurface-EnhancedSpectroscopy’,(Wiley,NewYork,,2002),Vol.1[12]HaynesC.L.,andVanDuyneR.P.:‘Plasmon-SampledSurface-EnhancedRamanExcitationSpectroscopy’,J.Phys.Chem.B,2003,107,7426~7433[13]HaynesC.L.,McFarlandA.D.,ZhaoL.,etal.:‘NanoparticleOptics:TheImportanceofRadiativeDipoleCouplinginTwo-DimensionalNanoparticleArrays’,J.Phys.Chem.B,2003,107,7337~7342[14]DirixY.,BastiaansenC.,CaseriW.,etal.:‘OrientedPearl-NecklaceArraysofMetallicNanoparticlesinPolymers:ANewRouteTowardPolarization-DependentColorFilters’,Adv.Mater.,1999,11,223~227[15]HaynesC.L.,andVanDuyneR.P.:‘DichroicOpticalPropertiesofExtendedNanostructuresFabricatedUsingAngle-ResolvedNanosphereLithography’,NanoLett.,2003,3,939~943[16]MaierS.A.,BrongersmaM.L.,KikP.G.,etal.:‘Plasmonics-ARoutetoNanoscaleOpticalDevices’,Adv.Mater.,2001,13,1501~1505[17]MaierS.A.,KikP.G.,AtwaterH.A.,etal.:‘Localdetectionofelectromagneticenergytransportbelowthediffractionlimitinmetalnanoparticleplasmonwaveguides’,NatureMater.,2003,2,229~232[18]ShelbyR.A.,SmithD.R.,andSchultzS.:‘Experimentalverificationofanegativeindexofrefraction’,Science,2001,292,77~78[19]AndersenP.C.,andRowlenK.L.:‘Brilliantopticalpropertiesofnanometricnoblemetalspheres,rods,andaperturearrays’,Appl.Spectrosc.7,2002,56,124A~135A[20]LoveJ.C.,EstroffL.A.,KriebelJ.K.,etal.Chem.Rev.2005,105,1103~1169[21]HutterE.,FendlerJ.H.Chem.Commun.2002,378~379[22]Haes,A.J.,VanDuyne,R.P.J.Am.Chem.Soc.2002,124,10596~10604[23]FrederixF.,FriedtJ.M.,Choi,K.H.,etal.Anal.Chem.2003,75,6894~6900[24]NathN.,ChilkotiA.J.Fluoresc.2004,14,377~389[25]StuartD.A.,YonzonC.R.,ZhangX.,etal.Anal.Chem.2005,77,4013~4019[26]SönnichsenC.,ReinhardB.M.,LiphardtJ.,etal.Nat.Biotechnol.2005,23,741~745[27]HaesA.J.,ChangL.,KleinW.L.,etal.J.Am.Chem.Soc.2005,127,2264~2271[28]HimmelhausM.,TakeiH.Sens.Actuators,B2000,63,24~30[29]JinR.,CaoY.,MirkinC.A.,etal.Science2001,294,1901~1903[30]ProdanE.,NordlanderP.,HalasN.J.NanoLett.2003,3,1411~1415[31]HaesA.J.,ZouS.,SchatzG.C.,etal.J.Phys.Chem.B2004,108,6961~6968[32]HaesA.J.;ZouS.,SchatzG.C.;etal.J.Phys.Chem.B2004,108,109~116[33]YonzonC.R.,JeoungE.,ZouS.,etal.J.Am.Chem.Soc.2004,126,12669~12676[34]HongX.,KaoF.J.Appl.Opt.2004,43,2868~2873[35]NathN.,ChilkotiA.Anal.Chem2004,76,5370~5378[36]UnderwoodS.,MulvaneyP.Langmuir1994,10,3427~3430[37]StuartD.A.,HaesA.J.,YonzonC.R.,eta1.Biologicalapplicationsoflocalisedsurfaceplasmonicphenomenae[J].IEEProc.Nanobiotechno1.,2005,152(1),13~32[38]RibohJ.C.,HaesA.J.,McFarlandA.D.,etal.(2003)JPhysChemB107,1772~1780[39]VanDuyneR.P.,HaesA.J.,McFarlandA.D.(2003)SPIE5223,197~207[40]HaesA.J.,ZouS.,SchatzG.C.,etal.J.Phys.Chem.B2004,inpress.[41]KreibigU.,VollmerM.,OpticalPropertiesofMetalClusters,Springer-Verlag,Heidelberg,1995.[42]HutterE.,FendlerJ.H.,Adv.Mater.16(2004)1685.[43]RiuJ.,MarotoA.,RiusF.X.,Talanta69(2006)288.[44]KreibigU.,Genzel[45]WagnerF.E.,HalsberckS.,StievanoL.,etal.Nature.407(2000)691.[46]MalinskyM.D,KellyK.L,SchatzG.C,etal.(2001)JAmChemSoc123,1471~1482[47]YonzonC.R.,JeoungE.,ZouS.,etal.J.Am.Chem.Soc.126(2004)12669.[48]JensenT.R.,MalinskyM.D.,HaynesC.L.,etal.:‘NanosphereLithography:TunableLocalizedSurfacePlasmonResonanceSpectraofSilverNanoparticles’,J.Phys.Chem.B,2000,104,10549~10556[49]MichaelsA.M.,NirmalM.,andBrusL.E.:‘SurfaceEnhancedRamanSpectroscopyofIndividualRhodamine6GMoleculesonLargeAgNanocrystals’,J.Am.Chem.Soc.,1999,121,9932~9939[50]SchultzS.,SmithD.R.,MockJ.J.,etal.:‘Single-targetmoleculedetectionwithnonbleachingmulticoloropticalimmunolabels’,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,2000,97,996~1001[51]YguerabideJ.,andYguerabideE.E.:‘Light-scatteringsubmicroscopicparticlesashighlyfluorescentanalogsandtheiruseastracerlabelsinclinicalandbiologicalapplications–II.Experimentalcharacterization’,Anal.Biochem.,1998,262,157~176[52]TatonT.A,LuG.,MirkinC.A.(2001)JAmChemSoc123,5164~5165[53]TatonT.A,MirkinC.A,LetsingerR.L(2000)Science289,1757~1760[54]SonnichsenC.,GeierS,HeckerN.E.,etal.(2000)ApplPhysLett77,2949~2951[55]SonnichsenC.,FranzlT.,WilkT.,etal.(2002)PhysRevLett88,0774021~0774024[56]BaoP.,FrutosA.G.,GreefC.,etal.(2002)AnalChem74,1792~1797[57]McFarlandA.D.,VanDuyneR.P.(2003)NanoLett3,1057~1062[58]