老琥草中鞣质和总黄酮类物质的提取

老琥草中鞣质和总黄酮类物质的提取

秋天草是牛蒡科植物。它是一种古老的鹳草科野生动物。干燥的土壤是多年生草本植物。它尝起来又重又苦，性格平。它进入肝、脾和肾。具有驱风、除湿、经络、缓解和腹泻的功效。常用于民间和实验研究。研究结果表明,鞣质具有多种生物活性,如抗肿瘤、抗过敏、抗衰老等,黄酮类化合物具有降脂、抗血栓、抗氧化、降糖等多种生理活性。老鹳草的主要化学成分包括鞣质、黄酮、有机酸、挥发油等,且以鞣质和黄酮尤为丰富。因此,老鹳草中鞣质与黄酮具有很大的研究及开发价值。为了获得经济实用的老鹳草中鞣质和黄酮类物质提取方法,笔者等以乙醇作为提取溶剂,分别运用渗漉法与超声提取法提取老鹳草中鞣质和总黄酮类化合物,用干酪素法测定鞣质含量,用比色法测定总黄酮含量,并对两种提取方法进行了比较。1材料和方法1.1材料表面1.1.1特芬材料购自兰州黄河中药材市场,经兰州大学药学院鉴定为老鹳草,用粉碎机打成粗粉备用。1.1.2槲皮素对照品没食子酸对照品(中国药品生物制品检定所,批号110831-200302);槲皮素对照品(中国药品生物制品检定所,批号100081-200406);Folin试剂:钨酸钠10g,加85%磷酸8mL,与蒸馏水75mL混合,加热回流3h,冷却后加水稀释至100mL,避光保存。其余试剂均为分析纯。1.1.3auw200e,koios公司,kueo分光光度计(Evolution60,Thermo公司),离心机(RC5Cplus,SORVALL公司),超声仪(SK5200LH,KUOOS公司),电子天平(AUW120D,SHIMADZU公司)。1.2实验方法1.2.1老氏草醇浸膏超声提取液与老鳌草醇浸膏的复合方法,及其比较超声提取液中新型助剂的含量测定以没食子酸为对照品,利用鞣质在碱性条件下与钨酸钠反应产生蓝色,其颜色深度与含量成正比的原理,测定老鹳草乙醇浸膏及超声提取液中鞣质含量;以槲皮素为对照品,利用黄酮类分子中的酚羟基可与Al3+在碱性溶液中显色的原理,测定老鹳草乙醇浸膏及超声提取液中总黄酮含量。1.2.2对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的没食子酸对照品20mg,置于100mL棕色容量瓶中,加90%乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液Ⅰ。精密称取干燥至恒重的槲皮素对照品6.7mg,置于25mL棕色容量瓶中,用90%乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液Ⅱ。1.2.3老连带树叶片浸膏的制备准确称取老鹳草粗粉2g,加90%乙醇约30mL,超声提取30min,提取后过滤,重复处理3次,用90%乙醇洗涤残渣,合并提取液至100mL棕色容量瓶中,加90%乙醇至刻度,摇匀,作为供试品溶液Ⅰ(生药浓度20mg/mL)。准确称取老鹳草粗粉2.0kg,用93%的工业酒精浸润后装入渗漉柱,加入该浓度酒精并使液面浸没药粉,于室温下密闭放置24h后,调节渗漉液呈匀速滴状流出。共加入10倍量酒精,过滤、合并滤液,在55℃下将渗漉液减压浓缩,挥干溶剂后得棕色浸膏(1g浸膏相当于25g生药材),浸膏置于4℃冰箱贮存。精密称取老鹳草浸膏100mg,用90%乙醇溶解并定容至50mL容量瓶中,摇匀,作为供试品溶液Ⅱ(生药浓度50mg/mL)。1.2.4folin试剂分别量取对照品溶液Ⅰ1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于10mL棕色容量瓶中,分别依次加入90%乙醇溶液4.0、3.0、2.0、1.0、0mL于各容量瓶中,然后加入0.1mol/L醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH5.0)至刻度,摇匀。分别量取各溶液1.0mL置于另一组10mL棕色容量瓶中,各加入Folin试剂0.5mL,再加1.5%碳酸钠溶液至刻度,摇匀,室温放置15min后离心5min(3000r/min)。以不加没食子酸的试剂混合液作为空白对照。将对照品溶液在500-900nm波长范围内进行光谱扫描,确定最大吸收波长,根据在最大吸收波长处的吸光度,绘制标准曲线,得出回归方程。精密量取对照品溶液Ⅱ0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL分别置于10mL棕色容量瓶中,加5%亚硝酸钠0.3mL,放置6min,加10%硝酸铝0.3mL,放置6min,加4%氢氧化钠2mL,加90%乙醇至刻度,摇匀,放置15min。以不加槲皮素标准品的试剂混合液作为空白对照。将对照品溶液在250-700nm波长范围内进行光谱扫描,确定最大吸收波长,根据在最大吸收波长处的吸光度,绘制标准曲线,得出回归方程。1.2.5精密度测试精密量取同一对照品溶液6份,在最大吸收波长处测定吸光度,计算RSD值。1.2.6稳定性试验待供试品溶液显色后,分别对供试品溶液Ⅰ、Ⅱ每隔30min在最大波长处测定一次吸光度,连续考察3h,分析样品含量差异。1.2.7样品含量的测量1.2.7.不同碳酸钠溶液的配制精密量取供试品溶液Ⅰ15mL、Ⅱ10mL分别盛于25mL棕色容量瓶中,各加入0.1mol/L醋酸-醋酸钠缓冲溶液10mL,再用90%乙醇定容至25mL、混匀,得样品溶液Ⅰ、Ⅱ;分别精密量取1mL,置10mL棕色容量瓶中,加入Folin试剂0.5mL,再加1.5%碳酸钠溶液至刻度,摇匀,室温放置15min,后离心5min(3000r/min)。在780nm波长处测定吸光度,按标准曲线计算出供试品溶液中没食子酸含量(mg)。1.2.7.供试品溶液中没食子酸含量mg的测定分别精密量取供试品溶液Ⅰ、Ⅱ各10mL,加至已盛有干酪素0.35g的50mL具塞锥形瓶中,密塞,置30℃摇床,100r/min振摇1h后,取出,放冷,摇匀,过滤,弃去初滤液,精密量取续滤液1mL,置10mL棕色容量瓶中,加入Folin试剂0.5mL,再加1.5%碳酸钠溶液至刻度,摇匀,室温放置15min,后离心5min(3000r/min)。在780nm波长处测定吸光度,按标准曲线回归方程计算出供试品溶液中没食子酸含量(mg)。按下式计算鞣质的含量:鞣质含量=总酚量-不被吸附的多酚量1.2.7.硝酸盐铝溶液的配制分别精密量取供试品溶液Ⅰ5mL、Ⅱ3mL,置10mL棕色容量瓶中,加5%亚硝酸钠0.3mL,放置6min,再加10%硝酸铝0.3mL,放置6min,加4%氢氧化钠2mL,加90%乙醇至刻度,摇匀,放置15min。在372nm波长处测定吸光度,按标准曲线回归方程计算出供试品溶液中总黄酮含量(mg)。2结果2.1根据老鹳草中铬含量的测定2.1.1标准曲线及线性范围将对照品溶液在500-900nm波长范围内进行光谱扫描,在780nm处均有最大吸收,故确定在780nm下测定各溶液的吸光度,在此波长处测定吸光度A为纵坐标,浓度C(mg/mL)为横坐标,得回归方程:A=123.665C+0.05427,r=0.99933,在0.002-0.010mg/mL的范围内,没食子酸浓度与吸光度有良好的线性关系。根据样品在780nm的光吸收值按标准曲线回归方程计算出供试品溶液中鞣质含量(mg),结果详见表1。2.1.2精密度测试在波长780nm处测定吸光度,RSD为1.2591%(n=6),结果表明仪器精密度良好。2.1.3显色后时间的确定待供试品溶液显色后,分别对供试品溶液Ⅰ、Ⅱ每隔30min在波长780nm处测定一次吸光度,连续考察3h,结果表明显色后15min至3h内样品含量无显著差异。表明供试品溶液在3h内稳定。2.2黄酮含量测定2.2.1线性关系将对照品溶液在250-700nm波长范围内进行光谱扫描,在372nm处均有最大吸收。以372nm处测吸光度A为纵坐标,浓度C(mg/mL)为横坐标,得回归方程A=47.485C+0.00629,r=0.9991,在0.00268-0.0134mg/mL范围内,槲皮素浓度与吸光度有良好的线性关系。根据样品在372nm的光吸收值,按标准曲线回归方程计算出供试品溶液中总黄酮含量(mg),结果详见表2。2.2.2精密度测试精密量取同一对照品溶液6份,在波长372nm处测定吸光度,RSD为2.6433%(n=6),结果表明仪器精密度良好。2.2.3显色后时间的确定待供试品溶液显色后,分别对两类供试品溶液每隔30min在波长372nm处测定一次吸光度,连续考察3h,结果表明显色后15min至3h内样品含量无显著差异。表明供试品溶液在3h内稳定。3讨论3.1生理活性的0.2法本实验采用罗文毓等设计的改良干酪素法测定鞣质含量,其特点在于干酪素能选择性地结合有生理活性的鞣质,因此测出的是具有生理活性的鞣质,而无生理活性的鞣