骨髓程序移植后回巢的变化

骨髓程序移植后回巢的变化

此前的研究表明，骨髓移植可以充分利用不断变化的基质，提高移植效率和存活率。单个骨髓移植可能会因缺乏足够的“基质”而导致大量移植细胞浪费。因此,本研究采用异基因小鼠骨髓移植模型、流式细胞仪检测方法,比较不同次数异基因骨髓细胞程序移植后不同时间点的回巢状况、不同细胞数异基因骨髓细胞程序移植与单次大剂量移植的回巢状况,探讨骨髓程序移植后移植次数与移植细胞数对回巢的影响。移植方法流式细胞术1.动物及模型:供体鼠为C57/6j(B6,H-2Kb)黑鼠和BALB/c白鼠(H-2Kb),6～8周龄,18～20g;受体鼠为BALB/c白鼠,6～8周龄,18～20g,均由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。2.试剂:RPMI1640培养基购自GIBCO生物公司;抗小鼠PE-H-2Kb单抗购自晶美生物工程公司。3.实验分组和移植方法(1)不同次数异基因骨髓细胞程序移植取受体鼠96只,随机分为1次、2次、3次、4次移植4组,每组24只。供体鼠每次移植细胞数为2.5×106个/只。各组分别在移植完成后24、48、72、96h4个时间点各处死6只,观察不同次数程序移植后不同时间点的回巢情况。(2)不同细胞数异基因骨髓细胞程序移植与单次大剂量移植比较:取受体鼠48只随机分为1×107×1、2.0×106×3、2.0×105×3、2.0×104×3共4个剂量组,每组12只。照射后4h各组分别移植1次,照射后12h,2.0×106、2.0×105、2.0×1043组各移植1次,照射后24h,2.0×106、2.0×105、2.0×104共3组各移植1次。移植后48h全部处死受体鼠,比较单次大剂量移植与多次小剂量程序移植的回巢情况。4.照射预处理和流式细胞仪等检测方法见参考文献。5.统计学处理:有核细胞计数(1×106/ml)和流式检测数据(%)以(x¯±s)(x¯±s)表示,组间比较用单因素方差分析,SPSS10.0软件包处理。结果1.不同时间点的异基因骨髓细胞移植效果(1)小鼠骨髓有核细胞计数移植后第2天至第5天各组间骨髓有核细胞计数比较差异无显著意义。移植后第1天至第7天各组平均骨髓有核细胞计数以第1天和第5天较低,分别为0.83±0.27、1.51±1.12,第6天、第7天逐渐升高分别为4.39±2.33、4.71±2.16(图1),差异有显著性(P<0.05)。(2)回巢h-2b阳性细胞比例移植后不同时间点各组骨髓中回巢H-2Kb阳性细胞比例1次组第2天最高,2次组、3次组、4次组均为第5天最高,组间差异具有非常显著性(P<0.01)。移植后第1天至第7天各组平均回巢H-2Kb阳性细胞比例以第2天和第5天较高,分别为5.91±2.21和8.47±4.11,第7天最低,为1.01±0.39(图2),差异具有非常显著性(P<0.01)。显示移植后移植细胞在一定的时间内每天都会有回巢,并且可能会有数个回巢高峰。(3)回巢细胞数及回巢率回巢的H-2Kb阳性细胞数与回巢率计算方法见参考文献。移植后各组不同时间点阳性回巢细胞数与回巢率均以第3次检测最高,在共同时间点第4天时均以2次移植组最高,分别为2.28±1.36(1×106),(45.23±27.26)%,差异有非常显著性。各组第1到第7天平均回巢细胞数第6天最高为1.76±1.41,第1天最低为0.32±0.10(P<0.05),平均回巢率以第2天最高为35.23±26.15,第7天最低为5.59±3.42(P<0.01)。提示不同移植次数有不同回巢规律。2.组回巢率、比较回巢阳性细胞数:1×107×1、2.0×106×3、2.0×105×3,3组之间差异无显著性,与2.0×104×3组比较差异有非常显著性(P<0.01)。回巢率:1×107×1、2.0×106×3两组之间无差异,2.0×105×3、2.0×104×3两组之间无差异,4组之间差异有非常显著性(P<0.01)。其中2.5×105×3组回巢细胞数与1×107×1、2.0×106×3两组无差异,但回巢率却远远高于后两组。异基因骨髓移植多次染源移植回巢模拟近年来基础研究与临床实践发现无血缘相关脐带血移植对于无适宜供体患者是一个理想的选择。目前脐带血移植的临床报告大多数是关于儿童患者的治疗结果,脐带血移植与骨髓移植相比造血恢复延迟、GVHD发病率和严重程度降低、生存率相等。少数成人脐带血移植的临床报告也显示了同样令人振奋的结果。但是,成人或大体重患者造血干细胞移植所需要的最小干/祖细胞数等问题,是使这种来源的造血干细胞更广泛地应用于需要异基因造血干细胞移植患者的关键。在以往的研究基础上,笔者采用异基因小鼠骨髓移植模型,利用内源性标记H-2Kb表型,不需要体外标记移植细胞,有利于动态观察每次异基因H-2Kb阳性细胞移植回巢情况,并尽可能减少了细胞标记过程和移植细胞增殖分化对检测的影响。实验结果显示①移植的骨髓细胞回巢到骨髓后,在移植后的第5天可能会发生快速增殖,对检测结果可能会有影响。②移植后每天都会有回巢发生,但不同移植次数可能在时间上有不同的回巢高峰阶段。③不同细胞数异基因骨髓细胞程序移植与单次大剂量移植的回巢状况发现:1×107×1,2.0×106×3,2.0×105×3,3组在移植细胞数相差1.7倍或17倍时回巢细胞数却相同,细胞总数少的移植组的回巢率远远高于细胞总数高的特别是单次大细胞移植组。上述结果提示在一定剂量范围内多次小剂量移植的回巢效果可能等于或好于单次大剂量移植,且总剂量可能降低至