医学分子生物学实验

医学分子生物学实验实验规范化操作微量高速离心机（样品分离）移液器（微量取液）高速离心机及使用注意事项台式高速冷冻离心机样品的分离落地式高速冷冻离心机微量高速离心机操作装液（1.5ml离心管或0.2mlPCR管）标记(记号笔)平衡（等体积相同管）放置（对称）离心（时间按钮，转速按钮）注意点：缓慢转动，记录时间停止（转速按钮回零，时间按钮回零，完全停止后轻轻取出离心管）使用注意事项1.样品需对称放置；2.先调节离心时间，离心开始缓慢提高转速至设定值；3.离心结束需等转子完全停止后才能打开离心盖，取出样品。移液器规范操作工作原理：活塞通过弹簧的伸缩运动实现吸液和放液。含内置活塞，依靠推动空气进行吸液和放液。实验结束时将移液器调至最大量程！量程的选择－移液器移液循环吸头安装容量设定预洗吸头吸液放液卸去吸头1、吸头安装旋转安装法:

把白套筒顶端插入吸头在轻轻用力下压的同时，把手中的移液器按逆时针方向旋转180度。切记用力不能过猛，更不能采取剁吸头的方法来进行安装，因为那样做会对您手中的移液器造成不必要的损伤。2、容量设定一是粗调，即通过排放按钮将容量值迅速调整至接近自己的预想值；二是细调，当容量值接近自己的预想值以后，应将移液器横置，水平放至自己的眼前，通过调节轮慢慢地将容量值调至预想值，从而避免视觉误差所造成的影响。在容量设定时，还有一个需要特别注意的地方。当我们从大值调整到小值时，刚好就行；但从小值调整到大值时，就需要调超三分之一圈后再返回，这是因为计数器里面有一定的空隙，需要弥补。3、预洗吸头

在我们安装了新的吸头或增大了容量值以后，应该把需要转移的液体吸取、排放两到三次，这样做是为了让吸头内壁形成一道同质液膜，确保移液工作的精度和准度，使整个移液过程具有极高的重现性。其次，在吸取有机溶剂或高挥发液体时，挥发性气体会在吸头室内形成负压，从而产生漏液的情况，这时就需要我们预洗四到六次，让吸头内的气体达到饱和，负压就会自动消失。4、吸液

先将移液器排放按钮按至第一停点，再将吸头垂直浸入液面，浸入的深度为：P2、P10小于或等于1毫米，P20、P100、P200小于或等于2毫米，P1000小于或等于3毫米，P5ML、P10ML小于或等于4毫米,平稳松开按钮，切记不能过快。垂直吸液；吸头尖端需浸入液面3mm以下；缓慢吸液；5、放液

放液时，吸头紧贴容器壁，先将排放按钮按至第一停点，略作停顿以后，再按至第二停点，这样做可以确保吸头内无残留液体。如果这样操作还有残留液体存在的话，您就应该考虑更换吸头了。完全打出，吸头尖靠内壁，排出最后的液滴；按钮待液体完全打出后再放松血清和粘性液体的吸液和放液速度都要保持缓慢正向吸液2个档位

1档

2档6、卸去吸头

卸掉的吸头一定不能和新吸头混放，以免产生交叉污染。用大量程的移液器移取小体积的液体装配吸头时气密性不好，吸头不匹配吸液速度和放液速度太快

自我检测漏气：吸取液体，垂直静置5秒，观察是否有液滴流出；规范操作，损坏赔偿！移液不准确的常见原因：实验报告要求实验报告按下列要求书写1.实验题目——当次实验2.实验原理——简明扼要，有针对性3.操作步骤——最好是流程或表格形式4.注意事项5.实验结果——图表、数据或现象6.结果分析——根据实验结果，结合理论分析、体会7.思考题碱裂解法提取重组质粒DNA医学分子生物学实验独立于染色体外，非宿主生长所必需，能进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒(plasmid)碱裂解法原理利用质粒DNA和染色体DNA的变性与复性的差异达到分离目的。强碱条件下破坏碱基配对，使宿主菌的染色体DNA变性解链，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配对，重新形成完全天然的超螺旋分子。

质粒DNA染色体DNA碱裂解法：在碱性条件（NaOH,pH12.0-12.6）下，用EDTA和SDS裂解细胞，并使细胞的蛋白质与DNA发生变性，释放出质粒DNA。细胞壁及膜的碎片与变性的蛋白质和染色体DNA形成缠连的、不溶性的网状、大的复合物，在高盐条件下可有效沉淀；当pH调至中性时，质粒DNA就可重新恢复天然的超螺旋，保留在上清液中，经离心可与染色体DNA等分离。苯酚可变性蛋白质；氯仿加速有机相和水相分离；异戊醇减少蛋白质变性过程中产生的气泡。使用预冷无水乙醇沉淀上清液中的质粒DNA，再用70%的乙醇洗涤。质粒DNA的提取步骤收集宿主细菌菌体裂解质粒分离去除杂质浓缩沉淀实验步骤：取已培养好菌液1.4ml,8000rpm离心1min,弃尽上清（倒扣，流尽液体）；菌体沉淀重悬于100μl预冷的溶液I中，振荡使菌体分散（使菌体完全重悬）；加200μl溶液II，盖紧管盖，温和颠倒混匀数次，室温静止5min（避免DNA断裂)；加150μl溶液III

，温和颠倒混匀数次，冰浴5min；10000rpm离心5min,取上清（？μl）至新的离心管中。加等体积苯酚/氯仿/异戊醇，颠倒混匀，12000rpm离心5min；取上清（？μl）至新的离心管中，加2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，冰浴10min，12000rpm离心5min；弃上清，沉淀加1ml预冷的70％乙醇洗涤，10000rpm/5min；弃尽上清，沉淀于温箱干燥后，加50μlTE溶液溶解，50℃水浴10min后，用于PCR和酶切。（不能残留乙醇）。溶液I，50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA，

pH8.0

溶液II，0.2MNaOH/1%SDS

溶液III，3M醋酸钠/2M醋酸思考题碱裂解法提取质粒DNA的原理和方法？溶液I，II，III的作用？苯酚，氯仿，异戊醇的作用？无水乙醇，70％乙醇的作用？TE溶液（pH8.0）,RNaseA的作用？聚合酶链式反应PCR实验原理

PCR技术是利用DNA的变性、复性原理在体外进行特定的DNA序列高效扩增的技术，在试管中，在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶进行的酶促合成反应，由变性-退火-延伸反复循环完成扩增。操作步骤1.反应体系的配置2.反应条件的设置3.产物的鉴定和分析重组质粒DNA质粒载体2692bpAmp＋目的基因(205bp)PCR反应体系(20µl)ddH2O14.0µl10×缓冲液（Buffer）2.0µldNTP2.0µlprimer1(P1)0.4µlprimer2(P2)0.4µlTaq酶0.2µl重组质粒DNA1.0µl空白对照：以H2O替代重组质粒DNA作为模板请使用合适量程加样器！20µlPCR反应步骤和条件：预变性94℃2min变性94℃20s

退火55℃20s

延伸72℃20s

延伸72℃5min

30cycles思考题PCR实验中造成假阳性的原因可能有哪些?PCR反应产物检测

——琼脂糖凝胶电泳目的要求掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸原理及方法；掌握荧光染料使DNA染色原理；掌握电泳结果观察分析方法;琼脂糖琼脂糖是从琼脂中提取出来的，由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖组成的链状多糖分子，可以形成具有刚性的网孔状凝胶。琼脂糖的浓度决定凝胶孔径的大小。-+实验原理

琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定核酸最常用的方法，在pH8.0的缓冲液中，核酸带负电荷，在电场中向正极移动，由于分子筛效应，可将分子大小和构象不同的核酸分子分离，不同浓度的凝胶可分离不同分子大小的DNA片段。

123456琼脂糖凝胶电泳系统紫外投射分析仪：凝胶成像系统琼脂糖凝胶电泳操作步骤样品：PCR产物

10µl加上样缓冲液2µl，加荧光染料如SybrGreenI

(SG)

2µl，混匀取10µl加入加样孔中(记录样品次序)110V稳压，电泳约至凝胶2/3处紫外灯下观察结果(与DNAMarker比较)记录并画出示意图注意：加样时持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住这只手的手腕，以减少移液器的抖动。加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外造成邻孔之间相互污染。上样缓冲液(LoadingBuffer)上样缓冲液组成：电泳指示剂与蔗糖(或甘油)组成上样缓冲液电泳指示剂：溴酚兰（紫兰色）二甲苯青（兰色）上样缓冲液作用：1）使样品呈色，便于加样操作2）增加样品密度和比重，以确保DNA样品均匀沉入加样孔内3）在电泳中形成肉眼可见的指示带，可判断DNA电泳的速度和位置荧光染料(如SYBRGreenI)SYBRGreenI

荧光染料SYBRGreenI嵌入DNA的碱基平面后，本身无荧光的DNA在紫外光激发下发出荧光，且荧光强度与DNA含量呈正比。DNA分子标准物(DNAMarker)DL20001kbDNALadder100bpDNALadder琼脂糖凝胶电泳优点：操作简便电泳速度快透明而不吸收紫外线，电泳后易染色和回收琼脂糖结构均匀，以其作为介质进行电泳得到的DNA条带清晰、分辨率高、重复性好琼脂糖凝胶电泳应用：核酸分离鉴定(质粒DNA分析)核酸产物分析(PCR产物分析；DNA酶切图谱分析)核酸纯化回收(基因克隆)影响DNA电泳迁移率的主要因素：

DNA的分子大小：线性双链DNA分子通过凝胶的速率与其分子量的常用对数成反比。

DNA的分子构象：相同分子量的闭环(Ⅰ型)，开环(Ⅱ型)和线状(Ⅲ型)的质粒DNA，在琼脂糖凝胶中电泳速率不同。迁移率Ⅰ型>Ⅲ型>Ⅱ型。

琼脂糖凝胶的浓度：一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率不同。在一定浓度的琼脂糖凝胶中，不同大小的DNA片段的迁移率也不同。

电场强度和离子强度线性双链DNA分子迁移率与其相对分子量成反比M1212121212100bp200bp300bp500bp1000bp电泳方向正极负极相同分子量不同构型的DNA分子迁移率不同三种构型的质粒电泳模式图谱超螺旋>线性>开环加样孔开环线性超螺旋琼脂糖凝胶浓度(%)线性DNA分子的有效分离范围(kb)0.61.0-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-42.00.1-3琼脂糖凝胶浓度和DNA分子的有效分离范围DNAMarker

(DL2000)M-PCRPCR产物电泳图300bp引物二聚体目的片段1234567891011121314

1.DNAmarker2-13.PCR扩增产物14.空白对照图1图2请评价和分析图1、图2PCR实验结果！思考题：1.琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA的基本原理？2.影响DNA电泳迁移率的因素有哪些？

3.上样缓冲液的成分和作用？重组质粒的限制酶酶切限制性核酸内切酶

（restrictionendonuclease,RE）简称限制酶，是一类能识别和切割双链DNA分子内特定碱基顺序的核酸内切酶，为原核生物所特有。Ⅱ型限制酶被称为基因工程的分子剪刀。实验原理

II型限制酶专一行性的识别4-6个具有回文结构的碱基序列，并在识别序列特定位置上切割DNA双链。酶切的效率受温度、pH、盐浓度等影响。酶切产物常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。重组质粒DNA

目的基因

GAPDH