第六章DNA重组与克隆课件

基因重组与基因工程GeneticRecombinationandGene

cloning

第六章基因重组与基因工程第六章1DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合称遗传重组或或基因重排。重组产物称为重组体。基因重组主要发生在减数分裂时同源染色体之间的交换。（形式多样）重组与进化关系密切，增加群体的遗传多样性，利于突变的优化组合。DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合称遗传重组或或基因2DNA重组接合作用(conjugation)转化作用(transformation)转导作用

(transduction)#转座

(transposition)#同源重组

(homologousrecombination)#位点特异的重组(site-specificrecombination)异常重组DNA重组接合作用(conjugation)转化作用(t3发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。6.1、同源重组发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousr4Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤①两个同源染色体DNA排列整齐②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体③通过分支移动产生异源双链DNA（立体异构）④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：片段重组体(patchrecombinant)拼接重组体(splicerecombinant)Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤①两个同源5片段重组体

：切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。

5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´片段重组体：拼接重组体：5´5´5´5´3´3´3´3´6

内切酶

(recBCD)DNA侵扰(recA)分支迁移

(recA)

内切酶(recBCD)

DNA

连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´目录内切酶DNA侵扰分支迁移内切酶DNA5´3´7片段重组体（见模型图左边产物）：

切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体（见模型图右边产物）：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。片段重组体（见模型图左边产物）：拼接重组体（见模型图右边85´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´9Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)DNA连接酶DNA连接酶片段重组体拼接重组体目录Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´10分支移动的过程伴随着DNA的修复分支移动的过程伴随着DNA的修复11同源重组是减数分裂的原因。同源重组是由于碱基间的精确配对实现的同源重组是减数分裂的原因。12异源双链与基因交换同源重组时会产生异源双链，从而发生基因交换。减数分裂后分离：（对异源双链区内不配对碱基的修复而进行的基因校正过程称作基因转换）基因转换频率在非对称异源双链区较高。基因转换也可以在有丝分裂时姐妹染色体的等位基因间、有丝分裂与减数分裂时同一条染色单体上非等位重复基因之间发生异源双链与基因交换同源重组时会产生异源双链，从而发生基因交换13Holliday模型提出了同源重组的基本模式，但对于基因重组具体细节，异源双链的形成细节不清楚。在Holliday基础上提出了单链断裂模型和双链断裂模型，两个模型的区别在于解释重组期间DNA的修复的具体过程不一样。有供体受体之分。（受体：发生链断裂的分子P138-139）Holliday模型提出了同源重组的基本模式，但对于基因重14细菌的基因转移与重组低等生物也可以以转化、转导、结合等多种方式实现细胞间的基因转移。具体方式：接合、转化、转导、细胞融合。外源基因的命运：降解、暂时保留、与内源基因置换、整合。细菌的基因转移与重组低等生物也可以以转化、转导、结合等多种方15

一、接合作用（conjugation)

当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接 触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至 另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用。

16

F因子编码表面排斥蛋白、切口酶、解螺旋酶、DNA转移通道蛋白等、F因子编码表面排斥蛋白、切口酶、解螺旋酶、DNA转移通17

F因子可以与细菌染色体发生交叉连接而重组整合入细菌染色体F因子可以与细菌染色体发生交叉连接而重组整合入细菌染色18

二、转化作用（transformation)

通过自动获取或人为地供给外源DNA， 使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。感受态细胞高浓度钙可以诱导感受态感受态细胞高浓度钙可以诱导感受态19例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。20

三、转导作用（transduction)

当病毒从被感染的细胞（供体） 释放出来，再次感染另一细胞（受体） 时，发生在供体细胞与受体细胞之间 的DNA转移及基因重组。

21溶菌感染重组感染细菌噬菌体图15-3转导作用转导：通过病毒介导发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组溶菌感染重组感染细菌噬菌体图15-3转22转导：当病毒从被感染的供体细胞释放出来，再次感染另一受体细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用转导(transduction)转导：当病毒从被感染的供体细胞释放出来，再次感染另一受体细胞23*转染(transfection)转染是转化的一种特殊形式。由transformation（转化）和infection（感染）两词构成。原指将噬菌体、病毒或以其为载体构建的重组子导入受体细胞的过程。通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染。将任何类型DNA转移至动物细胞内的过程均可叫转染。*转染(transfection)转染是转化的一种特殊形式。24细菌的细胞融合由于细胞质膜融合导致的基因转移和重组。（原生质体融合）细菌的细胞融合由于细胞质膜融合导致的基因转移和重组。25细菌的同源重组的酶学机制1、RecBCD（外切核酸酶Ⅴ）和Chi位点具有解旋酶（再旋）活性、ATPase活性、核酸外切酶活性、

序列特异性的单链内切酶活性单链内切酶活性和解旋酶活性使DNA产生具有游离末端的单链－－－RecA的作用位点RecBCD有固定切割位点原核生物的重组酶学机制已经比较清楚Chi位点出现几率很高，是RecBCD的靶位点GCTGGTGG细菌的同源重组的酶学机制1、RecBCD（外切核酸酶Ⅴ）和263‘◘RecBCD的识别和切割位点a、RecBCD结合在DNA的平头末端（产生机制不清楚）b、外切、解链、移动（ATP）c、兔耳状loop结构产生再旋酶活性低于解旋酶活性）d、RecBCD在loop单链区的

chi位点3‘方4～6NT处切断单链（单链内切酶）☀

chi位点：GCTGGTGG

目前发现的重组热点

E.coli

含1000个、Euk.3‘◘RecBCD的识别和切割位点a、RecBCD27e、RecBCD切割产生3’单链末端e、RecBCD切割产生3’单链末端28

2、RecA蛋白

（1）

活性a、RecA有单、双链DNA

结合活性b、RecA有NTPase活性（底物差异活性）与单链DNA结合时活性最大---依赖于DNAc、RecA有启动一个分子的单链侵入到另一双螺旋分子的能力，即联会同源DNA

（但其靶DNA必须有缺口－－结合DNA）2、RecA蛋白（1）活性a、RecA有单、双29第六章DNA重组与克隆课件30RecA入侵单链被置换连RecA引发链侵入模型RecA入侵单链被置换连RecA引发链侵入模型31RecA引起的链交换和Holliday结构的生成

RecA引起的链交换和Holliday结构的生成32

（2）RecA蛋白催化双链和单链DNA

的反应阶段a、联会前阶段（缓慢）

RecA与单链结合b、单链与双螺旋的互补链迅速配对，形成双链连接分子

Holliday（5‘侵入）c、从双螺旋结构中缓慢置换一条链产生一段长的异源双链DNA

反应结束时，RecA结合到双链上◘其中—单链同化有固定的方向入侵单链进入的方向是5’－3‘，双链DNA的互补链是3’－5‘（2）RecA蛋白催化双链和单链DNA的反应阶段a、33第六章DNA重组与克隆课件34◘RecBCD和

RecA的共同作用RecBCD产生游离单链---RECA因子接到重组反应◘RecBCD和RecBCD产生游离单链---35

3、原核同源重组的其它蛋白

需要E.coli中三个基因ruvA,ruvB和ruvC的产物a、RuvA识别Holliday结构的连接点b、RuvB为分枝迁移提供动力（ATPase10～20bp/s）c、RuvC核酸内切酶---专一性识别Holliday结构的连接点体外切段连接点以拆分重组体3、原核同源重组的其它蛋白需要E.coli中三个基36◘E.coli重组的各阶段（损伤修复）损伤DNA复制产生缺口RecA链交换第二次链交换DNApol通过DNA合成填满缺口RuvA,B分枝迁移RuvC切割Holliday连接点真核生物同源重组机制自学◘E.coli重组的各阶段损伤DNA复制产生缺口Re377.2、位点专一性重组（

site-specificrecombination）1、概念：发生在专一序列而顺序极少相同的DNA分子间的重组（包括一些基因表达调节、发育过程中DNA重排）噬菌体基因组整合到细菌染色体基因组中属此种重组2、特征：◘在特定的结合序列部位，有专一的酶催化断裂重接

----产生精确的DNA重排◘都具有整合作用的两个基本特征a、典型的保守性重组---交换是相互的和保存原先的DNAb、发生在噬菌体和细菌DNA短同源序列的专一性核苷酸上7.2、位点专一性重组（site-specificr38二、λphage的整合与切除（溶原和裂解状态）1、实现机制：均是通过---细菌DNA和λDNA上特定位点之间的重组2、特定位点-----附着位点（attachmentsiteatt）◘E.coliattB

含BOB’三序列23bp◘λphage

attP

含POP’三序列

240bp◘核心序列“O”完全一致

（同源部分）

---位点特异性重组发生的地方◘B,B’,P,P’---臂二、λphage的整合与切除（溶原和裂解状态）1、实现机制：393、整合过程◘整合后的附着位点为

attL（BOP’）

attR（POB’）◘整合位点---attB、attP

切除位点---attL、attR◘整合过程需要λ整合酶

（integraseInt）（λ编码）和寄主的整合宿主因子IHF

（integrationhostfactor）共同作用3、整合过程◘整合后的附着位点为◘整合位点---40溶源性细菌(lysogen)溶菌周期（lysis）原噬菌体溶源性细菌溶菌周期原噬菌体414、整合分子机制◘核心序列O全长15bp，富含A-T◘发生在O内的重组交换位点相距

7bp◘整合酶的结合位点：attP240bp、attB23bp(两者的作用不同)◘attP位点的负超螺旋为重组所必须---加强了Int和IHF的亲和力

-----高剂量的蛋白维持单链重组所必需的结构◘Int结合

----核心序列的反向位点（切割位置）

----结合在att臂上（臂与核心区靠近）4、整合分子机制◘核心序列O全长15bp，富含A-T◘42intIHFXisintIHFXis43◘整合体及其作用整合体（intasome）---Int和IHF结合到attP时的复合物◘整合体捕获attB

说明-----

a、attB和attP的最初识别靠Int

识别两序列的能力

b、两序列的同源性在链交换时为重要因素◘整合体及其作用◘整合体捕获attB44◘Int蛋白能切断DNA，并使它重新连接，近而使holliday结构拆分◘重组时attP和attB部位交叉断裂，互补单链末端进行交叉杂交◘Int蛋白能切断DNA，并使它重新连接，近而使hol45例（二）细菌的特异位点重组沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变例（二）细菌的特异位点重组沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变46hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一正向时驱动H2和rH1基因表达，反向(倒位)时H2和rH1不表达。rH1为H1的阻遏蛋白基因。hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特47H2鞭毛素

阻遏蛋白Hin重组酶转位片段hinH2IH1

H1鞭毛素hinH2IDNA启动序列H1启动序列沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变P197H2鞭毛素阻遏蛋白Hin重组酶转位片段hinH2IH487.3、转座成分概述1、转座子(元)或转座元件(transposonortransposableelement):

基因组上不必借助于同源序列就可以移动的DNA片段，它们可以直接从基因组的一个位点移到另一个位点（供体和受体）转座（transposition）：转座元的转移过程（不十分确切）2、发现和发展◘1914A.Emerson1936Marcus.M.Rhoabes

玉米果皮、糊粉层花斑突变

玉米籽粒糊粉层色素不稳定遗传机理

跳跃基因（jumpinggene）◘1947冷泉港实验室（美）BarbaraMcClintock7.3、转座成分概述1、转座子(元)或转座元件(transp49a)不依赖供体序列与靶位点间序列的同源性b)转座不是简单的转移，涉及转座子的复制Hotspots(热点)Regionalpreference(在3kb区域内的随机插入)d)某些转座因子（Tn3）对同类转座因子的插入具有排他性

（免疫性）e)靶序列在转座因子两侧会形成正向重复f)转座因子的切除与转座将产生复杂的遗传学效应3、转座重组的特点c)转座插入的靶位点并非完全随机（插入专一型）a)不依赖供体序列与靶位点间序列的同源性b)转座不是50二、Prok.转座子种类◘两种类型：简单转座子（simpletransposon）（插入序列insertionsequenceIS）复合转座子（compositetransposon）◘共同特征：a）两端有20～40bp的IR(反向重复序列)b）具有编码转座酶（transposase）的基因1、插入序列（最简单的转座子称作插入序列）◘最简单，是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的正常组分◘命名：IS＋编号（鉴定类型）长度700～2000bp二、Prok.转座子种类◘两种类型：简单转座子（si51◘特点：a）两端IR为转座酶的识别位点（突变）

b）插入靶位点后会出现靶位点的正向重复（3～9bp）◘特点：a）两端IR为转座酶的识别位点（突变）52◘IS可以正反方向插入到DNA（宿主、质粒或某些噬菌体），常对插入位点后面的基因表达功能产生极性效应◘IS可以正反方向插入到DNA（宿主、质粒或某些噬菌53a)Tn/TnAfamily

l具有IR、转座酶基因、调节基因（解离酶）、抗抗生素基因

l

Tn1(AmpR)Tn2(AmpR)Tn3(AmpR)Tn4(AmpRStrR)Tn5(KanR)Tn6(kanR)Tn7(StrRTmpR)Tn9(CamR)Tn10(TetR)

2.5kb20kb

Tn3IRTnpAResTnpRAmpRIR38bp38bp转座酶

regulatorβ-内酰胺酶

2、复合转座子◘两种类型a)Tn/TnAfamilyl具有IR、转54b）两端重复序列为IS的复合转座子

e.g.

IS插入到功能基因两端，可能形成复合转座因子ISISISISLISR臂中心区臂transpositionb）两端重复序列为IS的复合转座子e.g.IS插55◘当两个IS组件相同时，其中任一个都可行使转座功能◘不同时，主要依靠一个◘两侧的IS既可以是IR，又可以是DR状态（IR多）◘当两个IS组件相同时，其中任一个都可行使转座功能◘563转座噬菌体Muphage

（巨型转座子）

C

repressorforA,BB33kd与转座有关A70kd转座酶U,S

毒性蛋白attL,attR

与寄主同源，反向重复，转座必需GinG区倒位酶attLCABSUattR150bp1.5kb

G倒位区38kbPgin◘以E.coli为寄主的温和型噬菌体（溶源、裂解）3转座噬菌体Muphage（巨型转座子）C57◘Mu的插入途径a）侵入的Mu在溶源化过程中任意插入寄主DNA

（两侧各5bp的靶位点序列重复）b）进入裂解生长后，复制产生后代MuDNA几乎全部插入寄主

DNA中，并可继续转座（形成寄主DNA和Mu的共合体），噬菌体成熟时，切段共合体包装◘Mu的插入途径a）侵入的Mu在溶源化过程中任意插58三、转座子的转作机制及模式◘三种类型：复制型、非复制型和保守型1、复制型转座模式◘实质：转座子元件被复制并被移动到受体位点，最终转座过程扩增了转座子的拷贝（供、受点）◘需两种酶：转作酶（作用于原拷贝两末端）解离酶（作用于复制后的拷贝）◘模式：三、转座子的转作机制及模式◘三种类型：复制型、非复制型59◘两大步a)共合体形成切口－连接－复制◘两大步a)共合体形成60b)拆分

靶位点的DR形成b)拆分靶位点的DR形成612、非复制型转座模式◘供体上最终产生双链断裂◘供体位点如不能被修复则有致死效应2、非复制型转座模式◘供体上最终产生双链断裂◘供62五、转座子的某些遗传学效应－－P157转座可以导致基因变异插入操纵子位置可以影响操纵子下游基因表达应用：难以筛选的基因转移基因定位标记筛选插入突变构建特殊菌株克隆难以进行表型鉴定的基因五、转座子的某些遗传学效应－－P157637.3.6真核生物的转座成分P152自学7.3.6真核生物的转座成分P152自学64

真核生物的转座成分根据转座机制目前分为两类：a)

转座机制与细菌的转座子类似需要转座酶、两端的IR,转座靶点序列随机，遗传信息：DNA→DNA转座酶、转座因子两端的IR序列，◘玉米的Ac-Ds元件、果蝇的P元件和FB元件等b)

转作机制类似逆转录病毒真核生物特有的转座机制（逆转录转座）遗传信息：DNA→RNA→DNA逆转录子转录成RNA,然后反转录成DNA,插入基因组，类似于逆转录病毒的作用◘如：逆转录病毒、果蝇的copia元件、酵母的Ty元件逆转录酶和整合酶，P208逆转录酶生物学意义：影响其他基因表达，介导基因重排，促进基因的流动真核生物的转座成分根据转座机制目前分为两类：a)65第二节

重组DNA技术DNARecombinationTechnique第二节

重组DNA技术DNARecombinat66重组DNA技术的发展史年G.J.Mendel的豌豆杂交试验1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉重组DNA技术的发展史年G.J.Mendel的豌豆杂交试67一、相关概念DNA克隆工具酶目的基因基因载体二、基本原理及操作步骤本节主要内容一、相关概念本节主要内容68一、重组DNA技术相关概念克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。（一）DNA克隆一、重组DNA技术相关概念克隆(cl69DNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。DNA克隆70生物技术工程:

基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等。目的①分离获得某一目的基因或DNA②获得目的基因的表达产物（蛋白质）基因工程(geneticengineering)

——实现基因克隆所用的方法及相关的工作，又称重组DNA技术。生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等。71（二）工具酶

限制性核酸内切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆转录酶

T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶

TaqDNA聚合酶（二）工具酶限制性核酸内切酶72重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5

3

聚合、35

外切活性，而无53

外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功73限制性核酸内切酶

(restrictionendonuclease)识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ限制性核酸内切酶(restrictionendo74作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。分类：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类（基因工程技术中常用的是Ⅱ类）作用：分类：75第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名：Hin

dⅢ

属

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；命名：HindⅢ76Ⅱ类酶识别序列特点：

——

回文结构(palindrome)切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGⅡ类酶识别序列特点：切口：平端切口、粘端切口GGATCC77BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口BamHⅠGTCGGATCC+GGATCCHindⅡGTC78有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生79（三）目的基因cDNA(complementaryDNA)基因组DNA(genomicDNA)（三）目的基因cDNA(complementaryDN80（四）基因载体定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA（四）基因载体定义常用载体81克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。克隆载体(cloningvector)82载体的选择标准能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。载体的选择标准能自主复制；831.质粒

(plasmid)特点:

能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。1.质粒(plasmid)特点:细菌染色体外的小型84第六章DNA重组与克隆课件85λ噬菌体DNA改造系统λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）2.噬菌体(phage)

M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列λ噬菌体DNA改造系统2.噬菌体(phage)M13噬86

MultipleCloningSites

873.柯斯质粒(cosmid)pJB8的物理图谱3.柯斯质粒(cosmid)pJB8的物理图谱88酵母人工染色体

(yeastartificialchromosome,YAC)动物病毒DNA改造的载体腺病毒载体逆转录病毒载体杆状病毒载体其他酵母人工染色体其他89二、重组DNA技术基本原理目的基因的获取重组DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达

二、重组DNA技术基本原理目的基因的获取重组DNA导入受体菌90

以质粒为载体的DNA

克隆过程以91（一）目的基因的获取1.化学合成法已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)

（一）目的基因的获取1.化学合成法921.化学合成法由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列1.化学合成法由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列93组织或细胞染色体DNA基因片段克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌存在于转化细菌内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合2.基因组DNA文库组织或细胞染色体DNA基因片段克隆载体重组DNA分子含重组分94限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文库限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcosc95mRNA

cDNA

双链cDNA

重组DNA分子

cDNA文库

反转录酶载体受体菌复制3.

cDNA文库逆转录酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTTmRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子96

是一种在体外利用酶促反应大量获得特异序列的基因组DNA或cDNA的专门技术，又称为无细胞的分子克隆。4.聚合酶链反应（PCR）是一种在体外利用酶促反应大量获得特异序列的基因组DNA或97模板DNA引物4种dNTPTaqDNA聚合酶含Mg2+的缓冲液。PCR的反应体系

模板DNAPCR的反应体系98（1）变性，加热至95℃，使模板DNA解开成单链；（2）退火，温度降至适宜，使引物与模板互补结合；（3）延伸，温度升至72℃，DNA聚合酶以4种dNTP为底物，在引物的3’-OH上，合成与模板互补的DNA新链。PCR的基本反应步骤及原理

（1）变性，加热至95℃，使模板DNA解开成单链；PCR的99

PCR反应条件

变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚CPCR反应条件变性延伸退火100

PCR反应的基本原理PCR反应的基本原理101（三）外源基因与载体的连接1.粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接（二）克隆载体的选择和构建（三）外源基因与载体的连接1.粘性末端连接（二）克隆载体的102BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接BamHⅠ切割反应GGATCCT4DNA连接酶GATC103不同限制酶切位点的连接EcoRⅠ切割位点Bg

lⅡ切割位点+EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。不同限制酶切位点的连接EcoRⅠ切割位点BglⅡ切割位点1042.平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端2.平端连接105目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶重组体1063.同聚物加尾连接在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。3.同聚物加尾连接1075´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切限制酶5´3´

3´5´

5´3´T(T)nTT(T)nT3´5´5´

3´

3´5´

5´3´A(A)nA

A(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA连接酶15ºC重组体5´3´载体DNA5´3´目的基因限制酶或机械剪切限制酶1084.人工接头(linker)连接由平端加上带有新的酶切位点的接头，再用限制性酶切产生粘性末端，而进行粘端连接。4.人工接头(linker)连接109EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ人工接头及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ人工接头及其应用CCGA110受体菌条件安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent)

导入方式转化(transformation)转染(transfection)感染(infection)（四）重组DNA导入受体菌受体菌条件导入方式（四）重组DNA导入受体菌111（五）重组体的筛选

1.直接选择法

(1)抗药性标记选择

(2)标志补救(markerrescue)

(3)分子杂交法原位杂交Southern印迹

2.免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等（五）重组体的筛选112(插入失活法)抗药性标记选择(插入失活法)113组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因促进组氨酸合成λDNA重组体标志补救组氨酸缺陷无组氨酸酵母咪唑甘油磷促进组氨酸合成λDNA重组体114

α

互补的检测α互补的检测115原位杂交原位杂交116Southern印迹Southern印迹117鸡的β肌球蛋白的克隆和检出鸡的β肌球蛋白的克隆和检出118重组DNA技术操作过程可形象归纳为小结分分离目的基因切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体转转入受体菌筛筛选重组体重组DNA技术操作过程可形象归纳为小结分分离目的基119重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源120表达体系的建立表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化（六）克隆基因的表达表达体系的建立（六）克隆基因的表达1211.原核表达体系（E.coli表达体系最为常用）标准：选择标志 强启动子翻译调控序列 多接头克隆位点E.coli表达体系的不足

不宜表达真核基因组DNA不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusionbody)

很难表达大量可溶性蛋白1.原核表达体系（E.coli表达体系最为常用）122优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累缺点：操作技术难、费时、费钱转染

——将表达载体导入真核细胞的过程方法：磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染电穿孔脂质体转染显微注射2.真核表达体系

酵母、昆虫、哺乳类动物细胞优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA转染——将表123表达载体pFASTBACI的物理图谱表达载体pFASTBACI的物理图谱124第六章DNA重组与克隆课件125（一）疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。三、重组技术与医学的关系（二）生物制药（一）疾病基因的发现与克隆三、重组技术与医学的关系（二）生物126

重组DNA医药产品产品功能组织胞浆素原激活剂抗凝血液因子VIII促进凝血颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成促红细胞生成素剌激白细胞生成生长因子(bFGF,EGF)刺激细胞生长与分化生长素治疗侏儒症胰岛素治疗糖尿病干扰素(

1b,

2a,

2b,

)抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶抗组织损伤单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗乙肝疫苗(CHO,酵母)预防乙肝口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱重组DNA医药产品产品功能组织胞浆素原激127基因诊断(geneticdiagnosis)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。（三）基因诊断基本过程区分或鉴定DNA的异常分离、扩增待测的DNA片断基因诊断(geneticdiagnosis)是利用分子生物128标准.能正确扩增靶基因；.能准确区分单个碱基的差别；.本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定;.便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。标准129（四）基因治疗定义基因治疗(genetherapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。方式体细胞基因治疗(somaticcellgenetherapy)性细胞基因治疗(germlinegenetherapy)（四）基因治疗定义方式1301.产前诊断2.携带者测试3.症候前诊断4.遗传病易感性（五）遗传疾病的预防1.产前诊断（五）遗传疾病的预防131

复习思考题：

1.概念： （1）克隆 （2）转化 （3）转位 （4）基因工程 （5）转座 （6）限制性核酸内切酶 （7）载体 （8）G文库 （9）质粒 （10）c文库

2.简述基因工程的基本过程。

3.简述目的基因的主要来源或途径。

132DNA克隆及相关的基因操作技术及其应用在后续章节专门讲授DNA克隆及相关的基因操作技术及其应用在后续章节专门讲授1331、Geniusonlymeanshard-workingallone'slife.(Mendeleyer,RussianChemist)

天才只意味着终身不懈的努力。20.8.58.5.202011:0311:03:10Aug-2011:032、Ourdestinyoffersnotonlythecupofdespair,butthechaliceofopportunity.(RichardNixon,AmericanPresident)命运给予我们的不是失望之酒，而是机会之杯。二〇二〇年八月五日2020年8月5日星期三3、Patienceisbitter,butitsfruitissweet.(JeanJacquesRousseau,Frenchthinker)忍耐是痛苦的，但它的果实是甜蜜的。11:038.5.202011:038.5.202011:0311:03:108.5.202011:038.5.20204、Allthatyoudo,dowithyourmight;thingsdonebyhalvesareneverdoneright.----R.H.Stoddard,Americanpoet做一切事都应尽力而为，半途而废永远不行8.5.20208.5.202011:0311:0311:03:1011:03:105、Youhavetobelieveinyourself.That'sthesecretofsuccess.----CharlesChaplin人必须相信自己，这是成功的秘诀。-Wednesday,August5,2020August20Wednesday,August5,20208/5/20206、Almostanysituation---goodorbad---isaffectedbytheattitudewebringto.----LuciusAnnausSeneca差不多任何一种处境---无论是好是坏---都受到我们对待处境态度的影响。11时3分11时3分5-Aug-208.5.20207、Alth