西班牙语中最短尾短体线虫的分离鉴定

西班牙语中最短尾短体线虫的分离鉴定

2008年4月，广东省质量控制技术中心的植物检验室接受了来自印度尼西亚的火车舱（约1000g）的样品。该样品经浸泡、过筛,分离到数条短体线虫,经纯培养、形态观察、测量,以及rDNA-ITS、D2D3区扩增、测序及分析比对,鉴定为最短尾短体线虫(Pratylenchusbrachyurus(Godfrey,1929)Filipjev&SchuurmansStekhoven,1941)。1材料和方法1.1线分离将芋头浸泡10～24h,过筛分离获得数条线虫。1.2培养线虫挑取形态一致的短体线虫10条,在胡萝卜愈伤组织上培养。1.3形态观察与测量油/线虫感染法培养获得线虫于60～62℃水浴处理2～3min,将线虫杀死,用FG固定液(福尔马林:油:蒸馏水=10:1:89)固定。在光学显微镜下进行形态观察与测量。形态测计采用Deman公式。1.4绿虫的分子的鉴定1.4.1重组蛋白的制备在200μLEppendorf管中加入8μL预冷的PCRBuffer。在平玻片上滴20μLddH2O,挑入2条线虫,用手术刀将线虫切成2至多段,然后迅速吸取含尽量多的这些线虫片段的悬浮液10μL,加入含有8μLBuffer液的Eppendorf管中,再向管中加入2μL预冷的1mg/mL蛋白酶K,使总体积为20μL。迅速将管放入-70℃冰箱至少10min,而后将Eppendorf管置于PCR仪中65℃恒温60min,以降解DNase,接着95℃恒温10min,以变性蛋白酶K,此时即可取此DNA悬浮液1～2μL直接做PCR或-20℃保存。1.4.2分子检测1.4.2.pcr扩增ntp、引物、taqcda聚合酶PCR反应体系包括:10×PCRBuffer5μL,dNTP(10mmol/L)1μL,引物(10μmol/L)各1μL,模板DNA2μL,TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.25μL,ddH2O39.75μL,总体积50μL。1.4.2.ag-3下游引物的扩增采用通用引物,上游引物为5′-cgtaacaaggtagctgtag-3′,下游引物为5′-tcctccgctaaatgatatg-3′。扩增程序为95℃3min;95℃30s,52℃30s,72℃1.5min,35个循环;72℃5min;4℃保存。1.4.2.rtg-3pcr扩增程序采用通用引物,上游引物为5′-acaagtaccgtgagggaaagttg-3′,下游引物为5′-tcggaaggaaccagctacta-3′,扩增程序为95℃3min;95℃30s,50℃30s,72℃1.5min,35个循环;72℃5min;4℃保存。1.4.3体外观察和酶检使用1%的琼脂糖凝胶电泳,电压10V/cm,取PCR产物50μL上样。电泳30min后,在紫外灯下观察。将片段割胶回收,连接到pMD-18T载体后转入EscherichiacoliJM109菌株中,筛选4～5个阳性菌落测序。运用Mega4.0对扩增获得的ITS区、D2D3区序列进行分析,建立NJ系统进化树。2结果与分析2.1形态评价2.1.1肠道结构的排列雌虫虫体粗短,热杀死后虫体直或略腹弯。头环2个,头部有缢缩、头部边缘有棱角。口针长约18μm,口针基部球强壮、圆。食道腺腹面、侧面覆盖肠。排泄孔在半月体之后,位于食道与肠连接处。侧线4条,虫体中部的中间侧带偶尔有1～2条纵线或斜纹、或中间的两条侧线呈不连续的斜纹。生殖腺前伸,卵母细胞基本单行排列,受精囊不明显;阴门横裂,靠近虫体后部;后阴子宫囊长度不超过阴门处体宽,无分化。尾圆锥形,端圆、平截或斜截,尾端光滑、无环纹,尾端角质层增厚。雄虫未见(见图1)。2.1.2最短尾短体线虫—形态测量值(表1)从尼日利亚芋头中截获的短体线虫的主要特征及测量值与Loof、Ryss、VandenBerg、方羽生的描述基本相符,故初步判定该虫为最短尾短体线虫(Pratylenchusbrachyurus(Godfrey,1929)Filipjev&SchuurmansStekhoven,1941)。2.2酶的特性2.2.1部分片段的序列比对rDNA-ITS区片段扩增大约700bp的片段(见图2),将该片段切胶回收、纯化、克隆,挑取其中5个阳性菌落测序,获得长度分别为677bp、687bp、687bp、687bp、732bp的片段(Genbank登录序列号:HQ641381-641383),其中长度为687bp的3个片段序列完全相同,5个片段序列之间的相似度介于91%和100%之间。在NCBI进行BLAST比对与P.brachyurus(序列号分别为:FJ712897-712901)相似性最高,介于89.4%和93.0%之间。从进化树来看,与P.brachyurus(序列号分别为:FJ712897-712901)聚为一组,具有较高的同源性,与对照种P.neglectus的位于不同组(见图3)。2.2.2-内对于p.negerctus的序列的相似性分析D2D3区片段扩增大约800bp的片段(见图4),将该片段切胶回收、纯化、克隆,挑取其中4个阳性菌落测序,获得长度为777、777、777、781bp的序列(Genbank登录序列号:HQ641384-641386、HQ197923),4个片段序列之间的相似度介于98.0%和99.9%之间。在NCBI上进行BLAST比对与Pratylenchusbrachyurus(EU130842)相似性最高,介于95.9%和96.8%之间。从进化树来看,与Pratylenchusbrachyurus(序列号分别为:EU130842)聚为一组,具有较高的同源性,与对照种P.neglectus的位于不同组(见图5)。从BLAST的结果和短体线虫的进化树可进一步确定该虫为最短尾短体线虫(Pratylenchusbrachyurus)。3chus生物清髓种的群落特征本实验是在挑取数条形态一致的线虫基础上进行纯培养,经纯培养之后进行形态观察、测量、rDNA-ITS区和D2D3区序列的扩增、克隆、测序,所以排除了混杂其他种类线虫的可能。说明在短体线虫属内,部分种的不同单条线虫的rDNA重复序列是不同的,该结果与WaeyenbergeL,SubbotinSA等在Genbank上公布的结果一致。如WaeyenbergeL于2010年11月2日在Genbank上公布的同一种群的PratylenchusbrachyurusrDNA-ITS的不同克隆序列(序列号:FJ712897-FJ712901)相似性介于92.1%和100%之间;如SubbotinSA于2008年8月6日Genbank上公布的同一种群的PratylenchuszeaerDNA-ITS的不同克隆序列(序列号:EU130889-EU130896)的相似性介于90%～94%。1929年,最短尾短体线虫被首次发现于夏威夷的菠萝根际。该线虫广泛分布于热带地区,如埃塞俄比亚、几内亚、尼日利亚、巴西、古巴、澳大利亚、日本、印度,其寄主非常广泛,如菠萝、甘薯、水稻、棉花、咖啡、玉米、马铃薯、烟草、车前草、柑橘、大豆、花生、谷类等。在中国虽然有分布报道数次,但有形态描述只有2次,并且描述中未涉及受精囊、侧线变化等重要鉴定特征,又缺乏rDNA-ITS、D2D3序列特征。该虫在国内未广泛分布,为局部分布的非中国种,是我国禁止进境的检疫性线虫,并且为质检系统内首次截获。最短尾短体线虫为迁徙性内寄生线虫,在根毛区和根尖的皮层薄壁组织中取食,造成表皮薄壁组织坏死,形成病斑,病斑不断扩大并逐渐向中柱发