血瘀证细胞损伤模型的研究

血瘀证细胞损伤模型的研究

最近的临床和实验表明，一些血瘀证患者或动物模型中的血液循环障碍及血块性病理状态与血管内皮细胞的功能障碍和结构损伤密切相关。从血管内皮细胞功能障碍的角度来看，血瘀证的性质和活血化瘀法的建立已成为一种新方法。本研究运用细胞培养技术,用两种方法,即用血瘀证兔模型血管内皮细胞直接培养和用血瘀证兔模型血清损伤培养的血管内皮细胞,分析体外培养内皮细胞的形态结构及其内分泌功能的变化,探索建立血瘀证细胞损伤模型的可行性。1材料和方法1.1动物新西兰纯种兔,雄性,体重1kg?左右,购自广东省卫生厅医用实验动物场。1.2siga?成199培养液,为?Gibco?产品,胎牛血清、超级新生牛血清由杭州四季青生物工程材料研究所提供;胶原酶Ⅱ型购自?Sigma?公司,胰蛋白酶购自?EML?公司;兔抗人第?Ⅷ?因子相关抗原抗血清由上海生物制品研究所提供,羊抗兔?I?gG?荧光抗体由军事医科院微生物流行病研究所提供;牛血清白蛋白由新疆生化厂生产,去甲肾上腺素由广州明兴制药厂生产。内皮素(ET)碘标记放免药盒由解放军总医院东亚所提供,一氧化氮(NO)测试盒由军事医学科学院放射医学研究所提供。1.3型造模方法20只新西兰兔随机均分为正常对照组和血瘀证组。按我们以前报道的血瘀证兔模型造模方法,于兔耳静脉缓慢注射去甲肾上腺素0.1mg·kg-1·d-1,连续20d;于造模第1天同时静注牛血清白蛋白250mg/kg,间隔10d,再注射1次,共2次。正常对照组于同期注射等量生理盐水。1.4血清实验造模结束后(第21天)分别抽取两组动物的全血并分离兔血清,混匀除菌过滤及灭活后,4℃保存备用。1.5细胞培养方法1:每次实验各取血瘀证组和对照组兔1只,分离出主动脉,先后用胰蛋白酶和胶原酶消化,将获取的内皮细胞调整至5×104～1×105/mL,以3mL?细胞液种于培养皿,在50%?CO2?培养箱中静置培养。细胞原代培养8～10d后,细胞呈单层密集生长,近亚融合时,进行传代繁殖培养。方法2:分离2～3只正常新西兰兔的主动脉,同方法1用酶消化血管内皮细胞后,将细胞混合在一起进行原代和传代培养。将第5代呈单层融合的20瓶血管内皮细胞随机均分为2组,分别加入含体积分数为10%?自制的正常兔和血瘀证兔血清培养液,静置培养24h。1.6电镜观察观察内皮细胞的鉴定采用第?Ⅷ?因子间接免疫荧光检查。内皮细胞的形态学特征采用倒置显微镜和电镜观察。电镜检查方法:分别收集原代、传代培养及自制血清处理后的2组内皮细胞,按常规电镜样品制备法制备样品,用日电?JEM-100CX?Ⅱ/T?型透射电镜和?JSM-J300型扫描电镜观察。1.7内皮细胞内囊功能指标的检测1.7.1皮细胞融合、培养液制备分别收集原代和第5代培养的各组内皮细胞融合24h?后以及经两组兔血清作用24h后的培养液,4℃离心,取上清-20℃?保存。1.7.2细胞液测定和测定ET?检测按碘标记放免药盒说明书操作,使用仪器为?BeckmanGamma5500自动计数器,采用非平衡放射免疫法直接测定细胞液?ET?含量,结果以?ng/L?表示。1.7.3血浆中no稳定代谢产物的检测按药盒说明书进行操作,使用?Pharmacia4000型紫外分光光度计检测血浆中?NO-2(NO稳定的代谢产物之一)含量,以?NO-2?含量表示?NO?生成量,结果以?μmol/L?表示。1.8正态分布和方差齐时各组数据经正态性检验和方差齐性检验后,属正态分布和方差齐时,采用?t检验统计方法;若属非正态或方差不齐时,采用?Wilconxon?检验。2结果2.1原代内皮细胞的形态和内皮细胞的功能特点2.1.1两组原代内皮细胞的形态特征比较结果见表1。2.1.2no?et?含量测定情况见表2。结果表明血瘀证组原代培养液中的?NO?含量比正常对照组降低(P<0.01),ET?含量与正常对照组相比有增加趋势,但差异无显著性(P>0.05)。2.2代代相传内皮细胞的形态以及内皮细胞的内因功能特征2.2.1两组传代内皮细胞的内在功能比较见表3。结果表明模型组传代培养液中?ET、NO?的含量与正常对照组相比,差异均无显著性(P>0.05)。2.2.2两组传代内皮细胞的形态特征传代培养的细胞经第?Ⅷ?因子间接免疫荧光检查,证实培养的细胞为内皮细胞。正常组和血瘀证组传代培养内皮细胞的形态学特征比较见表4。2.3两组均血清对培养的正常内皮细胞形态及其内政部功能的影响2.3.1两组兔子血清对培养的正常内皮细胞形态特征的影响见表5。2.3.2血清内皮细胞培养液中et、no见表6。结果表明,经兔血清24h?处理后,与正常血清组相比,血瘀血清组内皮细胞培养液中?ET、NO?的含量都明显增加(P<0.01)。3形态结构检测细胞内皮细胞的含量?近年来,为了深入研究血瘀证及活血化瘀治则,人们建立了各种血瘀证动物模型,这对于阐明血瘀证的某些基本理论,筛选有效方药,补充临床研究之不足,起着重要的作用。但由于这些模型都属于在体研究,受神经、体液等因素的影响,使其对血瘀证实质及活血化瘀方药作用机理的阐明受到一定的限制。细胞培养技术作为体外实验的一种重要方法,可人为控制、干预各种影响因素,弥补体内实验之不足。用主动脉血管内皮细胞培养方法进行疾病的发病机理或活血化瘀药物作用机理的研究,国内外已有较多的报道,大多数从正常动物或人身上取材,然后在培养的内皮细胞中加入高脂血清、纤维蛋白等处理因素造成细胞的病理损伤。这些研究方法已在活血化瘀方药的筛选及阐明其机理方面发挥着重要作用,但不足之处是这种病理性损伤不能直接反映体内的“血瘀证”病理状态,只能作为一般细胞损伤模型,而不能作为血瘀证细胞损伤模型。本研究首先从已造模的整体血瘀证兔主动脉直接取材,进行内皮细胞培养,并与正常对照组兔内皮细胞的形态结构及其内分泌功能进行比较,观察其能否保持体内的病理特征。在实验中,除了用光镜和电子显微镜观察内皮细胞形态结构外,我们还检测了细胞培养液中的?ET?和?NO?含量。近来研究表明,血管内皮细胞作为一种内分泌器官能不断地分泌各种血管活性物质,其中就包括?ET?和?NO。ET?是迄今所知最强的缩血管多肽物质,NO?则具有舒血管作用,并能抑制血小板的聚集和粘附。ET?和?NO?在对血管舒缩运动中起着平衡调节作用,血管内皮细胞内分泌功能紊乱引起的两者平衡失调将导致血液循环系统的障碍。实验结果表明,与正常兔比较,模型组兔原代内皮细胞培养发现其病理结构改变,如细胞体积增大,细胞内饮液泡数量增多,部分细胞线粒体肿胀,内质网扩张等。另外,模型组原代细胞培养液中?NO?的含量比对照组明显减少,而?ET?含量则有上升趋势。这些都在一定程度上反映出与血瘀证整体动物模型的病理状态相一致。本实验将原代培养的兔模型组内皮细胞继续传代培养,当传至第5代时,无论是光镜还是电镜检查,原代培养时内皮细胞所表现的病理结构特征并未随传代而得以完全保留,损伤的内皮细胞随着细胞传代而被逐渐淘汰。模型组传代培养液中?ET、NO?等活性物质的含量与正常对照组基本一致,说明内皮细胞内分泌功能得以恢复,也体现了细胞结构与功能变化的统一。这是否由于细胞生长过程中其自身的新陈代谢作用及培养液中所含的营养因素如胎牛血清等导致细胞的自我修复,尚有待进一步研究。我们用血瘀证兔模型血管内皮细胞直接培养的方法,初步建立了血瘀证的细胞损伤模型,但由于原代培养的细胞损伤模型从开始整体造模到细胞模型建立的周期较长,且有一定难度,难以保留或复制。为此,我们设计了第二条途径,即用血瘀证兔模型血清损伤培养的正常兔血管内皮细胞方法,研制一种既能反映模型兔体内内皮细胞损伤的病理状态而又易于复制的血瘀证细胞损伤模型。第二种方法的实验结果表明,血瘀证兔模型血清造成体外培养的血管内皮细胞形态结构严重损伤,细胞内某些结构的病理变化与用第一种方法原代培养的细胞观察到的相类似。同时我们发现,经正常、模型两组兔血清作用24h?后,培养液中?ET?和NO?含量都显著增加,其中?NO?含量的变化与在用第一种方法建立的血瘀证细胞损伤模型培养液中以及血瘀证整体动物模型体内的情况不同。NO?是由?L-精氨酸和分子氧在一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase,NOS)催化下生成的,NOS?可分为组成型NOS(cNOS)和诱导型NOS?(iNOS)。目前已证实,NO?具有双重性,体内适量的?NO(由?cNOS?催化合成)参与机体的生理调节功能,舒张血管和抑制血小板聚集;在病理状态下,过量的?NO(由?iNOS?催化合成)可导致正常组织细胞的损伤,具有细胞毒性作用,据此推测本实验细胞培养液中的?NO?含量增加可能与模型血清刺激导致?iNOS?被激活有关。综上所述,本研究在我们以往的在体血瘀证动物模型研究基础上,用血瘀证兔模型血管内皮细胞直接培养和用血瘀证兔模型血清损伤培养的血管内皮细胞两种