蒲灵化瘀止痛方对子宫腺肌病小鼠异位及位内膜vegf、ens及微血管密度表达的影响

蒲灵化瘀止痛方对子宫腺肌病小鼠异位及位内膜vegf、ens及微血管密度表达的影响

子宫内源性子宫内膜综合征（adm）也称为内源性子宫内膜综合征，是子宫内膜中的腺体或间质性疾病，主要临床表现为月经增多、经期延长、经期延长、主临床表现为经期和怀孕。近年来,随着分子生物学的发展和对ADM病理生理学的深入研究,对ADM的发病机制有了新的认识,血管生成在ADM发病过程中起重要作用。血管内皮生长因子(VEGF)是目前所知作用最强的促血管生成因子,而内皮抑素(ENS)是目前已知最强的内源性血管形成抑制因子。研究发现异位内膜中VEGF、ENS表达均较在位内膜明显升高,且VEGF增幅大于ENS,提示异位内膜中以VEGF增强占主导,VEGF与ENS间的动态平衡被打破,使异位内膜向有利于血管生成的方向发展。微血管密度(MVD)是衡量血管生成的定量指标。魏绍斌教授在长期临床工作中,应用蒲灵化瘀止痛方治疗ADM疗效显著,能明显缓解疼痛,减少经量。本研究在取得较好临床疗效的基础上,进行动物实验研究,建立小鼠ADM模型,通过组织形态学观察,免疫组化法测定VEGF、ENS、MVD,探讨蒲灵化瘀止痛方治疗ADM的作用机理。现介绍如下:1材料和方法1.1实动管质中心提供健康雄性ICR小鼠,鼠龄6~7周,体质量为(28.0±2.5)g,由简阳动物实验中心提供,批号:SCXK(川2008-24),合格证号:川实动管质第7号。在取得实验动物开放系统使用许可证的实验室(成都中医药大学附属医院动物实验中心)饲养,许可证号:029。饲养室温度20~24℃,湿度45%~65%。分笼适应性喂养5天。1.2药物组成及孕三烯酮胶囊蒲灵化瘀止痛方由成都中医药大学附属医院制剂室熬制为浸膏后,稀释为高、中、低剂量。药物组成:蒲黄10g,五灵脂15g,没药10g,姜黄15g,水蛭6g,花蕊石15g等;孕三烯酮胶囊(北京紫竹药业有限公司生产,批号:53110101);丹莪妇康煎膏(昆明滇虹药业有限公司生产,批号:110503)。1.3侧宫剪出液口。请看左宫采用经腹同种异体小鼠垂体宫腔移植法。1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,常规腹部消毒,下腹正中偏右纵向切口2cm,分离出右侧子宫,在距两子宫连接处0.5cm处剪一小口。另取同周龄ICR雄鼠,引颈处死,立即开颅取出脑垂体,分成2份,将一份垂体从小切口注入右侧子宫内,用眼科镊将垂体轻轻推向卵巢侧子宫末端,无需缝合,将子宫放回腹腔后,腹腔内注入庆大霉素溶液0.25mL(1万U),常规关腹。术后常规饲养。1.4造模前后的给药将健康雌性未孕ICR小鼠(n=52)随机抽取6只设为空白组,其余46只小鼠按上述造模方法制作小鼠AM动物模型。造模饲养3个月后,随机抽取模型小鼠10只取异位组织送检,证实造模成功,再将其余36只造模动物随机分为蒲灵化瘀止痛方高、中、低剂量组、孕三烯酮组、丹莪妇康煎膏组和模型组。正常组和模型组每日灌胃蒸馏水0.02mL/g(体质量,下同),中药组每日灌胃蒲灵化瘀止痛方高、中、低剂量水溶液0.02mL/g,中药对照组每日灌胃丹莪妇康煎膏溶液0.02mL/g,相当于0.007g/g;西药对照组每周2次灌胃孕三烯酮水溶液0.02mL/g,相当于4×102mg/g,第1次于术后第2天给药,3天后第2次给药,以后每周相同时间给药,平时灌胃蒸馏水。连续喂药12周。1.5小鼠侧精子的采集末次给药24小时后颈椎脱臼处死小鼠,立即剖腹取出右侧子宫标本(据文献报道,垂体移植侧子宫腺肌病发病更快并且结节较为明显,本研究为右侧子宫,故本研究取各组ICR小鼠右侧子宫作为研究对象),置于10%中性福尔马林液中固定保存。1.6测试指标1.6.1阳性物质的积分光密度检测vegf,ens的表达采用Mias图形分析系统,在200倍视野下选择异位和在位内膜组织的被覆上皮中含阳性物质(即棕黄色颗粒物质)最多的3个区域浏览,测量阳性物质的积分光密度,以此表示VEGF,ENS的表达情况。1.7统计方法数据采用SPSS13.0统计软件处理,定量资料采用单因素方差分析,组间多重比较采用LSD-t检验,检验水准为α=0.05。2光镜下见模型小鼠精子内皮结构的变化各组动物处死后,打开腹腔见空白组6只小鼠子宫表面光滑,淡红色,粗细均匀,模型组及各治疗组小鼠子宫不同程度增大,暗红色,粗细不均,局部结节样突起。光镜下见模型组小鼠子宫内膜结构紊乱,部分与子宫肌层无分界线,6只小鼠的子宫肌层内可见腺细胞及间质细胞,且病灶处的腺体呈明显囊性扩张,病灶组织周围血管非常丰富;在位内膜腺细胞多呈柱状或低柱状,间质细胞排列疏松。各治疗组子宫内膜层结构较紊乱,部分与子宫肌层无明显分界线,小鼠子宫肌层内可见腺细胞及间质细胞,且病灶处的腺体呈轻度扩张,腺细胞体积较小,呈立方状,病灶组织周围血管较丰富;在位子宫内膜腺细胞多呈柱状或低柱状,间质细胞较疏松。2.1影响遗传因素和遗传因素2.1.1内膜vegf的形成2.1.1.小鼠原位内皮vegf表达变化光镜下见模型组异位内膜中VEGF阳性物质呈深棕色或棕黄色,分布较密;各用药组呈浅棕色或淡黄色,分布稀疏。半定量检测结果显示:蒲灵化瘀止痛方高、中剂量组、孕三烯酮组和丹莪妇康煎膏组小鼠异位内膜VEGF表达降低,其中蒲灵化瘀止痛方高剂量组降低最为明显,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01),其余各用药组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。蒲灵化瘀止痛方高剂量组与低剂量组比较差异有统计学意义(P<0.01),其余各用药组之间比较差异无统计学意义(P>0.05),见表1。2.1.1.蒲灵化瘀单次给药对小鼠vegf光镜下见空白组在位内膜中VEGF阳性物质呈淡棕色,分布均匀;模型组呈棕黄色,分布较密;各用药组与模型组比较,其深度有降低趋势,且分布稀疏。半定量检测结果显示:蒲灵化瘀止痛方高、中、低剂量组、孕三烯酮组、丹莪妇康煎膏组模型小鼠在位内膜VEGF表达降低,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。蒲灵化瘀止痛方高、中、低剂量组、孕三烯酮组、丹莪妇康煎膏组和模型组与空白组比较差异有统计学意义(P<0.01)。其余各用药组之间比较差异无统计学意义(P>0.05),见表2。2.1.2以内膜为表达2.1.2.度有不同程度的减少光镜下模型组异位内膜中ENS阳性物质呈深棕色或棕黄色,分布较密;各用药组与模型组比较,其深度有不同程度的减少,呈淡黄色或浅棕色,分布稀疏。半定量检测结果显示:蒲灵化瘀止痛方高、中、低剂量组、孕三烯酮组和丹莪妇康煎膏组模型小鼠异位内膜ENS的表达降低,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01),其余各用药组之间比较差异无统计学意义(P>0.05),见表3。2.1.2.度的减少者采用单一的浅充色光镜下模型组在位内膜中ENS阳性物质呈棕黄色,分布较致密,各用药组、空白组与模型组比较,其深度有不同程度的减少,呈淡黄色或浅棕色,分布稀疏。半定量检测结果显示:蒲灵化瘀止痛方高、中、低剂量组、孕三烯酮组、丹莪妇康煎膏组模型小鼠在位内膜ENS的表达降低,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01),空白组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01),其他各用药组之间差异无统计学意义(P>0.05),见表4。2.2影响位点内膜和位点内膜v-e的关系2.2.1蒲灵化瘀痛方对孕三烯酮的影响蒲灵化瘀止痛方高、中、低剂量组、孕三烯酮组、丹莪妇康煎膏组均能降低模型小鼠异位内膜VEGF/ENS的比值,其中蒲灵化瘀止痛方高剂量组、孕三烯酮组降低最为明显,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01);蒲灵化瘀止痛方高、低剂量组比较差异有统计学意义(P<0.05),蒲灵化瘀止痛方高与中剂量组、丹莪妇康煎膏组比较差异有统计学意义(P<0.01),见表5。2.2.2蒲灵化瘀痛方对vegf/ens浓度的影响蒲灵化瘀止痛方高、中、低剂量组、丹莪妇康煎膏组与模型组相比,对小鼠在位内膜VEGF/ENS的比值具有下调趋势,但差异无统计学意义(P>0.05),各用药组与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05),蒲灵化瘀止痛方高、中剂量组与孕三烯酮组比较差异有统计学意义(P<0.05),见表6。2.3影响维度和维度粘膜mvd的发现2.3.1两组呈浅用色,分布稀疏光镜下模型组异位内膜中MVD阳性物质呈深棕色,分布较密;各用药组呈浅棕色,分布稀疏。半定量检测结果示:蒲灵化瘀止痛方高、中、低剂量组、孕三烯酮组、丹莪妇康煎膏组能降低模型小鼠异位内膜MVD的表达,与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05),见表7。2.3.2模型小鼠表型检测光镜下空白组在位内膜中MVD阳性物质呈棕黄色;模型组呈淡黄色;各用药组与模型组比较,其深度有不同程度增加,呈棕黄色或深棕色,且分布较密。半定量检测结果显示:蒲灵化瘀止痛方高、中、低剂量组、孕三烯酮组、丹莪妇康煎膏组能增加模型小鼠在位内膜MVD的表达,其中蒲灵化瘀止痛方高、中、低剂量组增加最为明显,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01);蒲灵化瘀止痛方高剂量组、孕三烯酮组、丹莪妇康煎膏组、模型组与空白组比较差异有统计学意义(P<0.01);蒲灵化瘀止痛方高、中、低剂量组与孕三烯酮组、丹莪妇康煎膏组比较差异有统计学意义(P<0.01),见表8。3蒲灵化瘀单次用药,进展之四近年ADM发病率有明显上升且呈年轻化趋势,严重影响女性身体健康和生活质量。中医对ADM的病因病机进行探索,认为经期、产后或流产后摄生不慎,外有所感,内有所伤,导致冲任损伤及胞宫藏泻失司。月经期经血虽有所泻,但部分经血不循常道而逆行,致“离经之血”停于体内而成瘀血,“瘀血”是ADM的病理产物,亦是其病机关键。因此,活血化瘀是治疗本病的基本法则。魏绍斌教授结合多年临床经验,应用蒲黄、五灵脂、没药、姜黄、水蛭、花蕊石等治疗ADM,化瘀止痛止血效果显著,能明显缓解疼痛,减少经量。方中蒲黄、五灵脂化瘀止血,活血止痛;制没药、姜黄活血行气止痛;花蕊石散瘀止血止痛;水蛭破瘀逐血通经。全方共奏化瘀止血止痛,活血调经消癥之功。现代药理研究发现活血化瘀类方药有以下药理作用:改善血流动力学、改善血液流变性、抗血栓形成、改善血液循环、抗炎、镇痛、增强免疫、抑制组织异常增生等。本研究中蒲灵化瘀止痛方高、中、低剂量组,孕三烯酮组和丹莪妇康煎膏组均降低模型小鼠在位内膜VEGF、ENS、VEGF/ENS的表达,说明各药均可抑制模型小鼠在位内膜血管生成,减少在位内膜血管数量,提示蒲灵化瘀止痛方减少经量可能是通过抑制在位内膜血管生成,减少在位内膜血管数量实现的。蒲灵化瘀止痛方高、中剂量组,孕三烯酮组和丹莪妇康煎膏组降低模型小鼠异位内膜VEGF、ENS、MVD的表达,但VEGF的降低幅度明显大于ENS的幅度,使得VEGF/ENS比值降低,抑制因子力量大于促进因子力量,抑制了异位内膜血管生成,减少异位内膜血管数量,从而起到了治疗作用。由此推断,蒲灵化瘀止痛方缩小病灶、减轻痛经程度,可能是通过抑制异位内膜血管生成,减少异位内膜血管数量实现的。陈丽萍认为异位内膜侵入肌层深度不一定与痛经和月经过多呈正相关,故不能用异位内膜浸润深度解释ADM痛经和月经过多的原因及相互关系,其他因素如子宫内膜和月经血中前列腺素的含量增高,前列腺素类中PGF2α可使子宫和血管平滑肌收缩,PGE2则抑制子宫收缩,痛经患者经血中PGF2α明显增高,其PGF2α/PGE2比值明显高于无痛经者。蒲灵化瘀止痛方中五灵脂能显著降低炎症组织的前列腺素E(PGE)含量,本研究蒲灵化瘀止痛方是否同时降低了