德国医学学生对胰腺中有分泌激素的认识

德国医学学生对胰腺中有分泌激素的认识

胰岛素是身体最重要的内在激素之一，是维持正常新陈代谢、生长发育和健康生活所需的调节物质。胰岛素最主要的生理作用是:能与其他多种激素和自主神经系统一起,共同维持机体的血糖稳态,以保证机体对葡萄糖的正常利用。1胰岛素的发现1.1胰腺中细胞的聚集德国的医科大学学生鲍尔·朗格汉斯(PaulLangerhans,1847-1888),是柏林一位名医之子,在耶拿(Jena)和柏林的大学学习医学,毕业于1869年。同年,为了研究胰脏的组织结构,他在显微镜下观察多种动物的胰脏,发现胰腺中有一些细胞聚集成岛状的斑点,这些细胞形成无数个直径为0.1~0.24mm的“细胞堆”(德语zellhaufen)并且遍及整个胰腺,尤其胰尾处最多。朗格汉斯首次认真详细地描述了这些斑点的显微结构,将这些“细胞堆”中的细胞按大小、形状、有无颗粒等形态结构差异划分为9种。他没有对这些细胞的性质和重要性作出假设,当时医学界也没有认识到这一发现的价值。后来证明这些细胞有分泌激素的功能,他的发现才被重视。1893年法国组织学家EdounardLaguesse为了纪念朗格汉斯对医学所做的贡献,将他发现的这些岛状斑点命名为“ilotsdeLangerhans”(法语,ilots小岛的意思),由此许多文献和教科书中把胰腺中的这些岛状结构称为“isletsofLangerhans”即胰岛。1.2胰腺对糖尿病的影响1889年德国籍俄罗斯内科医生奥斯卡·明科夫斯基(OskarMinkowski)和德国生理学家约瑟夫·冯·梅林(JosephVonMering)用狗做实验对象研究胰腺的消化机能,他们无意中发现很多苍蝇叮在摘除胰腺狗的尿液上,而一般情况下不会有那么多苍蝇叮在健康狗的尿液上。他们对摘除胰腺狗的尿液进行检查,结果出乎意料,其中的糖分高达12%,他们继续研究发现,摘除胰腺的狗会患上和人类的糖尿病类似的疾病,但是,把胰腺的导管扎住,再把十二指肠切除,狗就不会患糖尿病。他们因此肯定,是和消化液无关的“某种物质”对糖尿病有抑制作用。明科夫斯基敏锐地意识到胰腺和糖尿病之间的决定性关系,并提出胰腺能够分泌某种抗糖尿病的物质的假说,并将他们的发现写成论文,发表在一本医学杂志上,在当时的医学界引起广泛关注。此后30年,全世界一流的科学家,在顶级设备的实验室里,都试图在胰腺里寻找某种能恢复代谢平衡的神秘物质,全都无功而返,30年来它一直是一种科学假说。1.3麦克劳德的胰岛素单次注射进展第1个提取出胰岛素的人是加拿大多伦多医生佛雷德里克·格兰特·班廷(FrederickGrantBanting,1891-1941,图1)。1920年10月,班廷在一篇文章中看到结石阻塞胰管引发的病变:胰腺中除胰岛之外全部细胞都萎缩了,但结石患者却没有患上糖尿病。于是班廷推想,若结扎动物胰管,使产生胰蛋白的细胞萎缩而产生胰腺激素的细胞不受影响,并将胰腺提取物注射进机体内,应该能治疗糖尿病。班廷决定通过实验证明自己的推断。1921年他向在多伦多大学任教的糖尿病权威约翰·麦克劳德(JohnJamesRichardMecleod,1876-1935)教授求助。麦克劳德在暑假将自己的实验室和10条狗借给班廷,并派自己的学生查尔斯·贝斯特(CharlesBest)当其助手。6周的时间过去了,他们一无所获,实验用的狗也陆续死亡,面对剩下的2周和4条狗,2人感到巨大的压力。就在最后期限的前几天,班廷发现1条狗的胰腺终于萎缩到原来的1/3。2人将该胰腺切片,在冰冻状态下磨成糜状,再加入生理盐水制成提取液,然后过滤,随后用分离的液体对1条因摘除胰腺而患上糖尿病的狗进行静脉注射。已经昏迷的狗情况有所好转,其血糖和尿糖都在下降,提取胰腺分泌物的方法找到了。他们把这种物质命名为“岛素”(eyelestin)。发表这一重大成果时,由实验室负责人麦克劳德用拉丁语表示“岛素”,将之命名为“胰岛素”(insulin)。1922年初,班廷给一位年少的糖尿病患者注射提纯后的胰腺提取物,经过一段时间的连续注射,患者的血糖逐渐下降,尿糖也在减少,直至恢复正常。生物化学家柯利普(CollipJ.P.)为提纯这种物质做出了贡献。糖尿病治疗的临床试验获得成功,并迅速得到推广,挽救了许多糖尿病患者的生命。胰岛素的临床效果被证明后的第2年(1923年),班廷和麦克劳德获得了诺贝尔生理学或医学奖。他们这么快就获得诺贝尔奖,是对其研究成果所产生的巨大社会价值的肯定。为了纪念班廷的功劳,1991年起,世界卫生组织和国际糖尿病联盟决定将班廷的生日11月14日定为“世界糖尿病日”。2对胰岛素结构的了解2.1桑格通过测定方法解决蛋白质连接顺序问题胰岛素卓越的疗效被证明之后,接下去的事情是研究它的化学结构。完成这项工作的是英国科学家桑格(FrederickSanger,1918-)。胰岛素是一种蛋白质,蛋白质是由氨基酸组成的,组成蛋白质的氨基酸有20种,20种氨基酸按照不同的顺序通过肽键(即酰胺键)连接,形成不同性质的蛋白质。长期以来人们一直无法解决蛋白质中各氨基酸连接顺序这道难题,而这个问题正是解决蛋白质结构的关键。桑格首先想到氨基酸有氨基和羧基,在蛋白质中除了氨基和羧基都已结合氨基酸外,有些氨基和羧基是游离的,未与其他氨基酸连接。如果找到能与残基结合的化合物,且连接较为牢固,那么将蛋白质水解后,连有这个化合物的氨基酸就表明它有一端本来是游离的。对于只有一个氨基和一个羧基的氨基酸来说就是末端的一个。桑格通过多年的研究,找到了化合物2、4-二硝基氟苯(FDNB),它可以和游离的氨基酸牢固结合,生成2、4-二硝基苯的衍生物(DNP),水解以后,这个衍生物呈现明亮的金黄色,很容易通过色谱和电泳分离并鉴定。FDNB后来被称为桑格试剂。桑格用这个试剂及电泳和色谱等方法,逐段分解测定,经过10年的努力,终于在1975年成功地完成牛胰岛素一级结构的测定。牛胰岛素由51个氨基酸残基组成,A链含21个氨基酸残基,B链含30个氨基酸残基,有2个链间二硫桥,A链还有一个链内二硫桥,如图2所示。这是人们第一次精确测定蛋白质的结构,为以后测定更复杂的蛋白质和研究胰岛素打下良好的基础。2.2人胰岛素a型1960年Nicol和Smith用经典的提取方法,从人尸体胰脏中首次获得少量的人胰岛素。用它作化学分析,首次得到人胰岛素的氨基酸组成,发现人胰岛素与动物胰岛素有差别(如下表所示)。1961年Berson证明,用注射动物胰岛素所产生的胰岛素抗体有的不结合人胰岛素,说明动物胰岛素与人胰岛素免疫原性不同。2.3研究结果与分析1969年英国科学家霍奇金(DorothyMaryCrowfootHodgkin,1910-1994)等人用X射线解析法研究了胰岛素晶体的结构,于1969年11月将研究结果发表在Nature杂志上,题目是《胰岛素二锌斜方六面体晶体的结构》。所得的分辨率为2.8埃,测出了胰岛素晶体的三维结构。1973年8月北京大学生物系和中国科学院生物物理所的科学家完成了猪胰岛素晶体三维结构的测定,研究结果发表在《中国科学》1974年第6期杂志上,分辨率为1.8埃。1975年霍奇金在Nature上发表一篇题为《ChineseWorkonInsulin》的文章,称“北京图谱目前是胰岛素最精确的图谱”。胰岛素三维结构的测定,为研究胰岛素高级结构与功能的关系打下基础。胰岛素的三维结构中,A链含有2个α-螺旋区:A1-A8和A12-A20,这2个α-螺旋的轴是逆向平行的。它们之间由延伸的袢相连,这一延伸的袢由链内的二硫键桥连。B链最明显的二级结构是B9-B19之间节段的α-螺旋,随后B20-B23形成β回折。剩余的B1-B8区域以及B23-B30区域处在一个延伸的构造中,如图3所示。胰岛素以锌胰岛素六聚体的形式储存在胰岛B细胞储存颗粒中。含有2个锌的胰岛素六聚体由3个相同的二聚体组成。在二聚体形成过程中,2个相邻单体分子的B24-B26氨基酸残基区域交互反应,形成逆向平行的β片层结构,4个氢键使二聚体更加稳定。B28的侧链吡咯环与二聚体中另一分子的B20-B23β回折之间有较强的疏水相互作用,这是二聚体形成的主要因素。单体胰岛素B链的α-螺旋区域和N端区域中疏水氨基酸之间进行连接,并通过2个Zn2+在六聚体中心轴附近的B10氨基酸残基上配位,使得二聚体聚合在一起。胰岛素分泌进入血液后,由于稀释作用,六聚体迅速解离形成胰岛素单体。3影响细胞增殖的物质胰岛素具有广泛的生物效应,调节糖、蛋白质和脂肪3大物质的代谢,影响细胞的生长、分化、增殖。作用于全身细胞尤其是肝、肌肉、脂肪及脑组织。3.1葡萄糖转动蛋白转糖在维持血糖稳定的过程中,胰岛素是降血糖激素,胰岛素缺乏则产生高血糖。胰岛素降低血糖的机制主要有3个方面:促进血糖进入细胞、促进各种组织利用葡萄糖及抑制肝糖异生。胰岛素促进葡萄糖进入细胞是通过刺激葡萄糖转动蛋白(GLUT)转运葡萄糖存于骨骼肌和脂肪组织中。在肝内胰岛素的作用主要是通过增强糖原合成酶系活性,加速肝对葡萄糖的摄取并合成糖原。例如,胰岛素刺激葡萄糖激酶,促进细胞内葡萄糖转变为6-磷酸葡萄糖,刺激糖原合成酶,加速肝糖原的合成,促进葡萄糖进入肝细胞。胰岛素促进各种组织对葡萄糖的利用是通过增加糖酵解过程的几种关键酶的量和活性来实现的。包括葡萄糖激酶、磷酸果糖激酶及丙酮酸激酶,使葡萄糖进入三羧酸循环转变为能量,糖酵解增加后,血浆中葡萄糖的量就会减少。胰岛素抑制糖异生是通过抑制糖异生酶的活性来实现的,如果糖1、6-二磷酸酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶。3.2脂肪细胞糖脂化成蛋白胰岛素对脂肪的合成和贮存起着非常重要的作用,在肝能加速葡萄糖合成脂肪酸,并转运到脂肪细胞中贮存。在脂肪细胞中,通过胰岛素作用摄取的葡萄糖大部分用于合成3-磷酸甘油,它和脂肪酸经脂化作用合成甘油三酯,贮存在脂肪细胞中。胰岛素能明显抑制脂肪细胞中激素敏感性脂酶的活性,抑制脂肪的分解。3.3对蛋白质合成的作用胰岛素促进蛋白质的合成,抑制蛋白质的分解,促进生长。胰岛素可在蛋白质合成的各个环节发挥作用,如加速氨基酸的跨膜转运进入细胞;促进DNA和RNA的复制和转录;加速核糖体的翻译,使蛋白质的合成增加。胰岛素和生长素协同作用时能明显促进生长。3.4在脂肪与一般信息中的调节胰岛素的神经中枢作用主要是影响进食行为,另外也参与自主神经系统的中枢调节。胰岛素在全身能量平衡调节中,是一种传入中枢神经系统(CNS)的“信号”。何谓能量平衡:大多数哺乳动物进食不均匀、不稳定,时多时少,食物中所含能量也有差别。因此机体通过脂肪的贮存和分解来调节,使机体的重量保持一种正常水平的稳态。此机制即能量平衡。中枢神经系统在这种调节中是重要的一环,因CNS某些部位可通过“饥饿感”(食欲感)或“饱足感”(厌食感)来调节动物吃东西。脂肪量过剩或缺乏是通过“体液信息因子”传达到脑组织的,这种体液因子的关键性物质是胰岛素。胰岛素进入CNS的作用是剂量(血浓度)依赖性的。4胰岛素的合成4.1人胰岛素原的制备胰岛素生物合成的最早前体为前胰岛素原(preproinsulin),其编码基因位于11号染色体的短臂上,含有3个外显子,分别编码前胰岛素原上的信号肽,B链和部分C肽以及其余C肽部分和A链。在胰岛的B细胞中经转录、翻译后形成前胰岛素原,含有110个氨基酸,11.5×103的多肽。在粗面内质网中,前胰岛素原迅速被蛋白酶水解,去除24个氨基酸的信号肽,形成含有86个氨基酸9×103多肽的人胰岛素原。胰岛素原包装在囊泡中并运输至高尔基体,在此,胰岛素原在成熟的囊泡内由蛋白酶水解去除连结肽(C肽),并从C肽两端切去Arg-Arg和Arg-Lys碱性二肽。转变为含51个氨基酸的胰岛素,如图4所示,并在分泌颗粒中与锌离子共同沉淀形成微结晶贮存。这种先合成前激素再分解成为激素的方式,是在胰岛素的生物合成过程中首先发现的,后来证明几乎所有激素的生物合成均通过这种方式进行。4.2开研发人胰岛素胰岛素广泛地存在于人和动物的胰脏中。天然胰岛素通常都是从猪或牛的胰脏组织中提取的,由于来源少、产量低,因此不仅价格十分昂贵,而且还存在着许多麻烦。长期使用猪胰岛素不仅会使患者产生一定程度的免疫反应,而且产生的抗体还会对患者的B细胞功能及内源胰岛素的分泌造成不良影响,于是利用基因工程生产人胰岛素,变成了一条行之有效的途径。自从1977年Rutter和Goodman首次成功克隆胰岛素基因,并用重组技术,大规模生产重组胰岛素以来,基因工程药物发展迅速。基因工程合成人胰岛素的生产工序如下:先将人胰岛素原基因“嵌合”入酵母菌质粒中,再将此重组质粒转染入酵母菌,酵母菌发酵大量繁殖后代,能向培养基中分泌人胰岛素。从培养基中提取,并经过多次重结晶、层析纯化。美国基因泰克(Genentech)公司1978年合成了人胰岛素。美国礼来(Elililly)公司从Genentech转让获得了生产基因工程胰岛素的权力,同时Vovo和BiogenS.A(瑞士)公司也获得了生产该产品的权力,自此世界范围内基因工程药物的研制和生产得到了飞速发展。丹麦NovoIndustri公司从1987年1月开始生产重组人胰岛素。2008年中国通化东宝药业股份公司开始生产基因重组人胰岛素,使中国成为继美国和丹麦之后第3个基因重组人胰岛素工业化生产的国家。4.3人工合成所需的生物活性质粒的人20世纪以来,由氨基酸合成寡肽,直至蛋白质,一直是科学家研究的热点。美国生物化学家梅里菲尔德(RobertBruceMerrifield,1921-)70年代用“固相化学合成法”合成了由51氨基酸组成的胰岛素。他的方法是把氨基酸的氨基与树脂粒子结合,然后把保护羧基的另一个氨基酸与之反应,生成二肽。用这种方法可以合成至少有20多个氨基酸组成的多肽,方法简便,效率高。化学合成法的重要性还在于开辟了医用蛋白质人工合成的先河,人类不必再依赖无法完全可靠的动物蛋白,可以通过人工方法大量地供应胰岛素。中国是第一个人工合成胰岛素的国家,1965年中国科学院上海生物化学研究所,与中国科学院上海有机化学研究所和北京大学生物系的科学家通力合作,经过6年多的艰苦工作,经历了多次失败后,终于在世界上第一次用人工方法合成出具有生物活性的蛋白质———结晶牛胰岛素。人工牛胰岛素的合成标志着人类在认识生命、探索生命奥秘的征途上迈出了重要一步。5在血液中测定胰岛素含量和药物胰岛素含量存在问题5.1人体胰岛素检测1947年,美国核物理学家罗莎琳·耶洛(RosalynYalou,1921-)和所罗门·A·贝尔松(SolomonA.Berson,1918-)将放射性同位素应用于医学领域。他们将放射性同位素示踪技术和免疫学结合起来,发展了放射性免疫检验术(RIA)。这种技术对测定血液或其他液体中的生物活性和药物性物质的微小浓度极为灵敏且易行。当时的美国约有1000万糖尿病患者,其中绝大多数患者体内的胰岛素并不缺乏,属病因不明的“成年糖尿病患者”,当时认为成年糖尿病患者体内的胰岛素可能被肝内的胰岛素酶所破坏。按照这种假说,胰岛素在糖尿病患者体内要比正常人消失的快。然而耶洛和贝尔松研究所得的结果却与此相反,即糖尿病患者体内较久地保持着标记的胰岛素。1959年耶洛运用RIA技术,第1次测定出人体血浆的胰岛素浓度,其精确程度从10-6提高到10-9甚至10-12的超微量水平,从而证实了成年人血浆中胰岛素并不缺少,只是与胰岛素抗体结合而丧失了降血糖的效能。RIA与第1架望远镜或显微镜在天文学或细胞生物学领域的意义相似,是现代内分泌学的一个里程碑,RIA的发明,开拓了生物学及医学研究的新天地。5.2“无定形胰岛素”20世纪80年代中期以前,药用胰岛素都是从牛或猪胰脏中提取的。基本工艺流程是:胰脏捣碎后用酒精提取,提取液用缓冲液中和呈中性后,真空抽干浓缩,再用NaCl盐析,沉淀得到含胰岛素的“盐饼”。盐饼溶于水后,pH调至5.0~5.5(胰岛素的等电点),使胰岛素沉淀下来,这就是“无定形胰岛素”(amorphousinsulin),其中胰岛素占50%~60%,生物效价10u/mg。当初用这种粗制胰岛素治疗糖尿病,非常有效,挽救了不少患者的生命。但这种制剂的不良反应很大,全身或局部的过敏反应者较多,甚至发生局部脓肿。20世纪40年代用“重结晶胰岛素”,纯度达97%以上,生物效价25u/mg。自重结晶胰岛素应用以后,全身的过敏反应基本消失,局部反应及脂肪萎缩也很少见,人们十分满意,认为药用胰岛素的免疫反应问题已经解决。直到1959年Yalow和Berson创建了灵敏度极高的放射免疫分析法,才检查出有90%以上采用重结晶胰岛素治疗的患者,血液中存在抗胰岛素抗体。有的抗体效价值还相当高,足以影响胰岛素的代谢和药效,有的患者胰岛素抗体较多,用药量增加。重结晶胰岛素的免疫原性,主要是其中含有少量(2%~3%)不纯物引起的。5.3有利于肝对营养的处理80多年来,药用胰岛素已取得了巨大进步。人类研究胰岛素的方向是希望尽量能模拟内生胰岛素的作用,但是至今药用胰岛素与内生胰岛素比较尚存在差距。药用胰岛素所用的剂量和给药的方法是人为定的,不能随血糖的波动而自动调整剂量。药用胰岛素在体内的代谢途经与内生胰岛素不同,内生胰岛素由胰岛分泌后先进入门静脉,在门静脉中的浓度高于外周血3~5倍。进餐后,门静脉血中从肠道吸收来的高浓度的营养物质加上门静脉血中的高浓度的胰岛素有利于肝对营养物质的处理。在肝中,胰岛素被摄取60%,剩下的经肝静脉进入体循环,而药用胰岛素在体内的方向恰好相反。药用胰岛素也不能产生生理性的胰岛内邻分泌调节。6新型人胰岛