《合成多肽药物药学研究技术指导原则》的几点思考

《合成多肽药物药学研究技术指导原则》的几点思考

2007年10月，国家食品药品监督管理局（fda）发布了《合成多媒体药物应用技术指南》（以下简称“指南原则”）。该指南的出版对国内合成多媒体药物的开发和注册起到了积极的指导和参考作用。由于合成多肽药物一方面属于化学药物的范畴,另一方面其制备方法、结构研究、质量研究等都有着与其他化学药物不同的特点,而且在合成多肽的某些研究领域(如立体结构研究)仍存在一些技术难题,因此课题组将本指导原则定位于:在已有的指导原则基础上,根据多肽药物研究技术的最新进展,结合国内对多肽药物研究和评价的实践经验,对合成多肽药物药学研究方面所涉及的特殊问题进行分析、总结,提出合成多肽药物各项药学研究的一般要求。在具体内容的表述上,本指导原则重点在于阐明合成多肽药学研究的特点、提出研究需关注的问题,在内容上偏重于原则性要求,同时也不再涉及与其他化学药物基本一致的一般性研究内容和技术要求。本文主要是结合药品技术审评过程中遇到的一些共性问题就合成多肽药物的结构确证、质量研究中的几个关键问题对《合成多肽药物药学研究技术指导原则》做进一步解读。1不同长度多肽的结构确证本指导原则对合成多肽结构确证研究的表述比较充分,技术要求也较为明确。尽管指导原则提到了很多结构研究方法,并对不同长度多肽的结构确证提出了不同的要求,看上去较为繁杂,但是多肽结构研究的目的是非常明确的,那就是“要说明其氨基酸组成和序列是否正确”,研究者需要紧紧围绕这一核心目的开展研究工作。当然,从广义角度来看,某些多肽的氨基酸序列还包含空间构象问题。以下谨针对实际工作中经常遇到的几个常见问题进行解读。1.1氨基酸序列与肽的连接顺序在审评工作中会遇到个别研究者未进行合成多肽的氨基酸序列研究,其主要理由为该多肽采用固相合成工艺制备且氨基酸组成分析结果显示其组成正确。实际上,氨基酸组成分析系用于说明多肽组成的正确性,而氨基酸序列研究则是直观的说明多肽中氨基酸连接顺序是否正确,两者的研究目的不一致。而采用固相合成工艺只能是从侧面、间接地说明氨基酸的连接顺序,并不能独立作为一项结构确证性研究。因此,合成多肽结构确证研究中必须包含氨基酸序列研究内容,这也是FDA和EMEA的常规要求。氨基酸序列研究方法既包括通常采用的Edman降解,对于一些短肽有时也可采用质谱、核磁共振谱等来说明其序列。另外,本指导原则还明确说明,对于一些不能直接确定序列的多肽可采用内切酶先将多肽裂解成小片段、再分析各片段序列的方法。1.2短肽、中肽、长肽的内涵本指导原则分别针对短肽和中、长肽的结构确证研究提出了建议和要求,质量研究部分也有类似的表述。但是如何界定短肽和中、长肽?指导原则中并未给出准确定义。这一问题是本指导原则起草过程中争论最多的问题之一。课题组在本指导原则起草和征求意见过程中咨询了大量专家和业界代表,均未能得到明确意见,有的认为5个氨基酸残基以下算短肽,有的认为是8个氨基酸,有些则认为20个氨基酸以下均为短肽。另外,目前国内外权威专业书籍、论著也均未能准确定义短肽、中肽、长肽的长度。因此,本指导原则暂未对“短肽”、“中肽”、“长肽”的长度进行定义,而是采用原则性的表述方式。本指导原则针对不同长度多肽的结构研究多采用原则性、建议性的表述方式,也并未完全按照多肽的长短严格区分相关技术要求,评价的关键是研究结果是否能充分确证其结构。例如,对于短肽,指导原则表述为“采用一般有机化合物常用的结构研究方法例如元素分析、红外光谱、核磁共振谱、质谱等,结合理化常数测定、化学纯度和光学纯度分析等,有时就足以说明其结构特征”。但是,如果上述研究方法尚不能说明多肽组成和序列的正确性,指导原则同样要求“进行氨基酸序列测定”。1.3指导原则中的多肽结构研究多肽的空间结构研究也是业界非常关注的一个问题。课题组针对该问题进行了充分地讨论并广泛征求了意见,基本的观点为:一些长肽需要具有一定的空间结构才能发挥活性,应开展空间结构研究,但研究工作难度较大,目前多为研究、试验性方法。基于上述认识,课题组认为指导原则中应明确提出多肽的空间结构研究,但其技术要求又不能超越现阶段的技术能力。因此,本指导原则关于多肽空间结构研究部分同样采用了原则性表述方式。需要注意的是,原则性表述并不代表没有要求。在实际工作中,如果已经有文献报道、试验研究显示某一多肽或其类似物需要维持一定空间结构才能发挥作用,那么研究者必须开展相应的空间结构研究。2主要内容和相关要求质量研究是药品注册研究的核心内容之一,合成多肽类药物也不例外,因此本指导原则用了大量的篇幅来阐述多肽药物质量研究的主要内容和相关要求。总结来说,合成多肽药物的质量研究一方面要参考一般化学药物的质量研究内容和研究思路,另一方面还必须结合合成多肽的结构特征、工艺特点和生物学特性等进行针对性的研究。本文重点是对合成多肽药物质量研究中具有多肽特色的部分内容进行解读,同时基于合成多肽制剂及其质量研究的特点,本部分主要针对合成多肽原料药的质量研究工作进行论述。2.1合成多肽药物的研究重点合成多肽原料药的质量研究除参考一般化学药物的研究思路进行常规项目的研究外,还应根据合成多肽的结构特征、制备工艺特点和生物学特点等进行针对性的研究,研究项目(原料药)一般包括:外观性状、理化常数、鉴别、氨基酸组成分析、水分、反离子含量、多肽纯度、有机溶剂和反应试剂残留量、生物学安全性检查、多肽含量或活性效价测定等,这其中以下几项研究内容由于与普通化学药物有所不同需要研究者特别关注:①合成多肽药物必须进行氨基酸组成分析,要求订入质量标准并建议参照USP或EP中同类产品的标准严格拟订各氨基酸的限度,稳定氨基酸的组成通常应在理论值的90%～100%范围内。②合成多肽的理化常数研究应关注等电点、溶解性等项目,其中进行溶解性研究时溶剂一般采用水和不同pH值的缓冲液。③对于一些中长肽而言,相对于常规的化学方法和色谱方法,肽图分析是具有很高专属性的多肽鉴别方法。④合成多肽药物通常以与一定反离子(通常为醋酸根)成盐的形式存在,因此需要进行反离子含量研究并订入质量标准。反离子的含量要控制在一定限度范围内,如10.0%～15.0%。⑤对某些多肽(如一些长肽、具有一定空间结构的多肽),质量研究内容还需包括聚合体检查、生物学安全性检查、活性测定等,相关内容下文将会重点介绍。2.2合成多肽过程中易出现的问题有关物质(对于多肽药物通常也称为相关肽)研究是合成多肽药物药学研究的一项重要内容,由于合成多肽本身结构、合成工艺以及稳定性方面的特殊性,这类药物的有关物质研究较为复杂、存在一定的难度,在实际审评工作中遇到的问题也最多。以下就根据指导原则的技术要求并结合注册审评工作对合成多肽药物有关物质的特点、研究的难点和关注点进行解读。2.2.1合成多媒体药物的性质和研究难度合成多肽的有关物质主要为源于合成过程带来的工艺杂质和由于多肽不稳定而产生的降解产物、聚合物等。2.2.1.合成多肽过程中杂质的性质和应用尽管目前合成多肽的纯化工艺已经有了很大进步,但工艺杂质仍是合成多肽有关物质的重要来源,这主要是由于合成多肽的一些工艺杂质(如缺失肽、断裂肽、氧化肽、二硫键交换的产物等)与药物本身的性质可能非常近似,从而给纯化造成了一定的难度。而且,不同的多肽合成方法也在很大程度上决定了终产品中杂质的性质,例如液相合成和固相合成所引入的工艺杂质就会明显不同,固相合成中Boc合成法与Fmoc合成法所产生的杂质也会有所差异,甚至不同的保护/脱保护策略都会带来不同的工艺杂质。因此,在进行合成多肽的有关物质研究时,研究者必须结合自身的工艺特点对可能由此引入的杂质有充分认识,从而才能够建立有针对性的有关物质研究方法。同时,这也意味着,对于仿制产品而言不能盲目照搬国家标准、已上市产品的有关物质检查方法,必须充分考虑到产品本身的工艺特点。2.2.1.合成多肽中的氨基酸多肽的化学稳定性和物理稳定性一般较差,因此降解产物、聚合物等是合成多肽有关物质研究的主要对象之一。影响合成多肽稳定性的因素包括脱酰胺、氧化、水解、二硫键错配、消旋、β-消除、聚集等,研究显示合成多肽中最常见的降解产物是脱酰胺产物、氧化产物、水解产物等。在组成多肽的各种氨基酸中,天冬酰胺、谷胺酰胺易于发生脱酰胺反应(尤其是在pH值升高和高温条件下);甲硫氨酸、半胱氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸最易氧化,对光照也较为敏感;天冬氨酸参与形成的肽链较易断裂,尤其是Asp-Pro和Asp-Gly肽键。由于1个多肽分子中通常会含有多种不稳定性的氨基酸残基或肽键,因此合成多肽可能的降解机制和降解产物较为复杂。而多肽的聚集主要是由于疏水作用引发的,尽管目前还很难准确预测哪些多肽易发生聚集,但至少对于一些中长肽而言需对可能存在聚合物进行研究。综上,由于结构、合成工艺和稳定性方面的特殊性,合成多肽中可能存在着大量性质各不相同的工艺杂质、降解产物、聚合物,这就给合成多肽药物的有关物质研究带来了很大的挑战。除了合成多肽中杂质不易定性、定量外,由于合成多肽中有些杂质的性质与终产品非常接近,有些杂质的性质又相差较大,建立适宜的方法充分检出这些杂质是合成多肽药物有关物质研究中的最大困难。2.2.2关于合成多媒体药物的材料研究应该注意以下几点2.2.2.合成多肽的研究方法由于合成多肽中有关物质的复杂性,且某一特定研究方法总会存在一定的局限性,因此对于合成多肽药物、尤其是新合成多肽的有关物质研究而言,通常需同时结合使用不同原理的方法进行有关物质研究。一般认为,对合成多肽杂质认知的程度与研究中使用的独立技术的数量成正比。常见的合成多肽的有关物质研究方法包括基于各种不同原理的高效液相色谱法(如反相HPLC法、离子交换HPLC法、分子排阻HPLC法)、毛细管电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)以及激光散射等。其中,反相HPLC法基于疏水性的分离机制,离子交换HPLC法依据多肽分子所带电荷的差异,毛细管电泳的分离基础是荷质比。分子排阻HPLC法的分辨能力虽然较反相HPLC法低,但相对于其他HPLC方法而言较适用于聚合物的检查。此外,激光散射法是目前测定多肽中聚合物的有效方法。2.2.2.梯度洗脱方法的检查方法目前,反相HPLC法是最常用的合成多肽有关物质研究方法。但是由于合成多肽中存在的有关物质的性质相差较大,采用简单的等度洗脱的方法往往很难充分检出产品中存在的各种有机杂质。对于合成多肽类药物,已有大量研究显示采用梯度洗脱方法无论是检出的杂质个数还是检出杂质的含量均明显高于等度洗脱方法。例如,在实际工作中遇到过一个按注册分类3申报的多肽,最初采用自拟的等度洗脱方法检查有关物质,可检出2个杂质峰,杂质总量为0.3%(面积归一化法),之后参照国外药典改为梯度洗脱方法,检出的杂质峰数增加至5个,杂质总量增至0.7%。目前,国外上市的合成多肽产品(醋酸丙氨瑞林、醋酸奥曲肽、特利加压素、鲑降钙素、生长抑素等)的有关物质检查方法多采用梯度洗脱方法。因此,采用反相HPLC法进行合成多肽有关物质研究时应尽量采用梯度洗脱方法,当然梯度程序的选择应以尽可能多的检出杂质为前提。2.2.2.强制降解试验专属性是评价杂质研究方法的重要指标。目前,国内很多研究者在对合成多肽有关物质检查方法的专属性进行验证的时候通常仅进行强制降解试验。然而,由于杂质来源的不同,合成多肽通常存在的工艺杂质的检查专属性很难通过强制降解试验进行验证。因此除进行强制降解试验外,研究者还应采用精制纯化前含有典型工艺杂质的多肽粗品进行有关物质研究方法的专属性考察。采用多肽粗品进行研究除了能够更加全面地验证杂质研究方法的专属性外,还有助于考察多肽合成过程中精制纯化工艺的合理性。2.3合成多肽的生物安全性问题本指导原则中所指的生物安全性检查包括过敏试验、降压物质、升压物质、异常毒性检查以及长肽的免疫原性或抗原活性检查等。在本指导原则起草过程中,对于是否要在指导原则中规定生物安全性检查一直存在争议。反对者认为,生物安全性检查一般是针对由发酵或从动物组织提取得到的产品,这类产品纯度不高,可能含有大量组胺乃至蛋白质等组分而易导致风险,而本指导原则只针对采用化学合成工艺制备的多肽,其杂质含量明显减少,应该不会存在生物安全性问题。支持者则认为,尽管合成多肽的纯度很高,但是基于其化学组成的特殊性,合成多肽尤其是长肽本身是否会产生生物安全性反应尚不明确,而且合成多肽药物多采用注射给药,从严格控制风险角度来讲需要对这类药物的生物安全性问题进行研究。课题组经充分讨论并广泛征求专家和企业代表的意见,从控制风险的角度出发并考虑到将来可能会有50个、100个甚至更多氨基酸残基的合成多肽药物出现,最终将生物安全性研究写入了指导原则,但采用了相对比较原则的表述方法:①纯度检查有时难以从根本上有效控制产品安全性,需要进行必要的生物学安全性检查。②根据产品具体情况,对于长肽,有时尚需进行免疫原性或抗原活性等生物特性的研究。这种处理方式与现阶段人们对合成多肽药物的认识相符,回避了机械的刚性要求,无论对于研究者还是评价者都留下了一定的空间。例如,对于像奥曲肽这种上市多年、有大量临床使用经验的合成多肽,人们对其安全性的认识较为充分,再进行一些动物体内甚至体外的生物安全性研究的意义就不大了。但对于一个全新的多肽、尤其是长肽,进行上述研究还是很有必要的,有助于全面控制产品质量、保证安全性,降低风险。2.4活性的测定方法本指导原则要求“对于具有一定空间结构才能发挥其活性的多肽,需进行生物学方法或酶化学方法测定药物活性(效价)的研究,包括含量与活性的关系、相应的方法学验证等”,这主要是考虑到对于这种具有一定空间结构