供体室和受体室紫花苜蓿根系间菌丝网络形成的时间效应

供体室和受体室紫花苜蓿根系间菌丝网络形成的时间效应

氨基葡萄糖菌（amf）能形成80%以上的共生系统，占土壤微生物总数的5%36%。这是土壤中最大的几种细菌。菌根真菌与宿主植物形成共生后,能改善植物的养分和水分状况,促进植物生长,提高植物对生物和非生物胁迫的耐性和抗性,维持生态系统生产力和稳定性。丛枝菌根真菌侵染宿主植物根系后,一方面在植物根内形成丛枝结构,另一方面向根外延伸,在土壤中形成菌丝网络。由于丛枝菌根真菌的宿主专一性不强,根外菌丝在延伸过程中可侵染其他植物根系,从而形成植物根间菌丝网络。研究表明,同种或不同植物根系间均能形成根间菌丝网络,而菌丝网络对植物间的资源(养分)再分配有重要作用,可以实现从资源丰富方(源)向资源匮乏方(库)的传递,包括碳、磷和氮的传递,从而影响植物系统内的资源配置,进而调节系统生产力。微生物空间格局受多种因子如土壤类型、pH和植被等的影响。自然草原生态系统中,土壤中的真菌群落在小尺度上,即土壤质地可视为均一的局域内同样具有较大的空间异质性,这会造成相邻植物菌根共生程度的动态差异。菌丝网络做为菌根真菌二次侵染的良好载体,在相邻植物菌根共生形成中发挥着重要作用。反言之,菌丝网络的形成也会受到介导植物生物学特性及土壤理化性质的影响。紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是典型的多年生优质豆科牧草,栽培地域广,种植面积大,其营养、饲用价值居于各种牧草之首,其在培肥和土壤改良中也具有重要作用,因而广泛用于干旱、贫瘠及污染土壤的生态恢复研究。十字花科植物独行菜(LepidiumspetalumL.)是典型的非菌根宿主植物,禾本科植物羊草[Leymuschinensis(Trin.exBunge)Tzvelev]是典型的草原建群种,具有庞大的根茎系统,自然条件下菌根侵染率和菌根依赖性均较低,但二者与紫花苜蓿在自然生态系统中广泛共存。本研究以紫花苜蓿为主要供试植物,通过三分室根箱系统,在一侧分室对紫花苜蓿接种丛枝菌根真菌做为供体植物,研究时间和不同植物的介导作用对另一侧受体紫花苜蓿菌根共生和生长的影响,旨在揭示植物根间菌丝网络的形成机制及其在调节植物种间关系中的作用,从而为全面认识丛枝菌根真菌的生态功能并推动菌根技术的生态应用提供科学依据。1材料和方法1.1土壤微生物指标供试土壤采自中国科学院植物研究所多伦恢复生态学试验示范研究站(116.48°E,42.18°N)。土壤基本理化性质如下:pH值(水土比1∶2.5)7.02,速效磷(0.5mol/LNaHCO3提取,钼锑抗比色)6.73mg/kg,速效氮(碱解氮)8.46mg/kg(按鲍士旦的方法测定)。土壤过2mm筛后辐照灭菌(25kGy,中国农业科学院原子能所辐照中心),并添加土壤微生物过滤液。供试植物为紫花苜蓿(购于北京金土地技术研究所)、羊草(吉林羊草研究所提供)和独行菜(购于国家蔬菜工程技术研究中心)。丛枝菌根真菌菌种为根内球囊霉(GlomusintraradicesBGCAH01),由北京市农林科学院中国丛枝菌根真菌种质资源库(BGC)提供,采用湿筛倾析—蔗糖离心法筛取菌剂中的孢子作为接种剂。试验采用如图1所示的PVC板加工的三分室根箱作为培养容器,分室间以孔径37μm的尼龙网分隔,允许菌根根外菌丝穿过而植物根系无法穿过。1.2方法及设备在植物生长和生理生长过程中的作用本研究包括两部分试验:(1)时间效应试验:在分室培养系统的供体室和受体室均种植紫花苜蓿,并在供体室接种丛枝菌根真菌,采用孢子接种的方法,3000个孢子/盆。中间分室不做任何处理。相同处理总计16盆,在植物生长8周、10周、12周和14周时4次收获,每次收获4盆。(2)介导植物效应试验:供体室和受体室种植植物及接种菌根真菌处理同时间效应试验,但在中间区隔分室分别种植紫花苜蓿、羊草或独行菜,并设置无介导植物对照。植物生长12周后收获。试验共4个处理,每个处理设5次重复。两个试验均在中国科学院生态环境研究中心人工智能温室中进行。试验前挑选大小一致且籽粒饱满的植物种子,用10%H2O2表面消毒10min,再以蒸馏水冲洗多次后于25℃恒温培养箱催芽,出芽后播种。出苗1周后间苗,每分室留苗3株。试验期间温室内温度设定为25℃,空气湿度为60%,白天时长14h,光照不足时以高压钠灯补光。植物生长期间定期浇灌去离子水,称重法保持土壤重量含水量在15%(田间持水量70%左右)。1.3指标和方法的测量1.3.1烘干前后根系样品的测定植物地上部和地下部分别收获,并用自来水和去离子水冲洗干净,置80℃烘箱中烘至恒重后称取干物重。根系样品在烘干前先分析根长。采用扫描仪(EpsonV700,Japan)将根系扫描成电子图像,应用Win-Rhizo(Regent,Canada)软件对根系扫描图像进行分析,获得植物根长数据。1.3.2乳酸甘油染色菌根侵染率采用曲利苯蓝染色-根段法测定。随机挑选部分植物根系,洗净后剪成约1cm左右小段,10%KOH90℃软化60min,水洗后用2%的HCl酸化5min,直接加入含0.05%曲利苯蓝的乳酸甘油溶液90℃染色30min,乳酸甘油溶液脱色。随机挑选30条脱色好的根段制片镜检。1.3.3病原菌感染密度测定菌根菌丝密度采用曲利苯蓝染色-方格交叉法测定。取过2mm筛的4g土壤样品混合100mL水和12mL3.7%六偏磷酸钠溶液,经振荡30s后静置2.5min,过0.05mm筛,收集筛上过滤物于匀浆机搅拌20s,静置10s,吸取5mL于0.22μm微孔滤膜抽滤,曲利苯蓝染色制片,显微镜下观测,根据菌丝与方格网线交叉点计数计算菌丝密度。1.3.4等离子体发射法检测植株全磷将烘干植物样品用球磨仪(Retsch-MM400,Germany)粉碎,称取0.5000g至消解管中,加入10mL优级纯硝酸,微波消解萃取仪(CEM-MARS,USA)消解,50mL容量瓶定容后过滤,用全谱直读等离子体发射光谱仪(Leeman-Prodigy,USA)测定植株全磷含量。1.4数据分析方法所有试验数据用MicrosoftExcel进行均值和标准误计算并作图,菌根侵染率通过反正弦(arcsin)转化,使用SPSS统计软件(SPSS16.0forWindows,SPSSInc,Chicago,USA)对数据进行统计分析。对供体植物和受体植物观测数据采用双因素方差分析,而对受体室菌丝密度及介导植物观测数据进行单因素方差分析。根据方差分析结果采用Duncan新复极差法对各处理进行多重比较。2结果与分析2.1培养时间和诱导植物对细菌根侵入的影响2.1.1种植物对不同区域菌根初始生长的影响在时间效应试验中,植物培养8周时供体和受体植物紫花苜蓿根系均可检测到典型的菌根共生结构,但供体植物菌根侵染率显著高于受体植物(高出2.63倍);随培养时间延长,供体和受体植物菌根侵染率均逐渐升高,10周以后两者已无显著差异(图2,A)。试验结果表明供体和受体植物之间的菌丝网络在第8周即已建成,而到第10周菌丝网络发展已趋于稳定。在介导植物效应试验中,介导植物对供体和受体紫花苜蓿的菌根侵染率均无显著影响;所有处理中紫花苜蓿根系均能与菌根真菌形成良好共生,菌根侵染率在26%～44%之间(图2,B)。基于不同植物生物学特性存在差异,我们预期不同介导植物会对菌丝网络的发育产生不同的影响,但试验结果并没有证实这一假设。这可能和具体试验条件有关。菌丝网络的发育是一个动态过程,时间效应试验显示菌丝网络在第10周已趋于稳定,至第12周介导植物的影响可能已经难以显现。不过,这也说明在较长时间尺度下菌丝网络可能会形成一个比较稳定的系统。2.1.2周不同周后a在时间效应试验中,植物培养8周至10周,受体室菌丝密度显著升高,但10周以后变化不明显,维持在一个较稳定的水平(图3,A)。与菌根侵染率相一致,第12周试验收获时不同介导植物对受体室菌丝密度均无显著影响(图3,B)。2.2植物地上部和根系生物量供体和受体植物地上部和根系生物量均随培养时间延长而显著增加,且供体植物生物量始终高于受体植物,二者之间的差异随时间延长而逐渐增大(图4,A、B)。这表明菌丝网络可导致植物种内的非对称性竞争,作为提供菌根真菌侵染源的供体植物可能通过菌丝网络获得竞争优势,最终导致植物群落内部植株个体大小差异。同时,介导植物也显著影响到供体和受体植物地上部和根系生物量(图4,C、D)。与间隔室无介导植物处理(CK)相比,介导植物均显著降低了供体紫花苜蓿地上部和根系生物量:以紫花苜蓿为介导植物情况下,供体植物地上部干重降低33%,根系干重降低47%;以羊草为介导植物情况下,供体植物地上部干重降低32%,根系干重降低52%;而以独行菜为介导植物时,供体植物地上部干重降低17%,根系干重降低37%。介导植物也使受体植物生物量有一定程度降低,但未达到显著水平。在间隔室无介导植物(CK)和种植独行菜情况下,供体植物地上部和根系生物量均显著高于受体植物:无介导植物时,供体植物地上部干重比受体植物高出48%,根系干重高出1.36倍;以独行菜为介导植物情况下,供体植物地上部干重比受体植物高出32%,而根系干重则高出86%。在羊草和紫花苜蓿为介导植物情况下供体和受体植物生物量无显著差异。很明显,介导植物的存在改变了供体和受体植物的关系格局,而且不同介导植物因为自身生物学特性存在差异,对养分资源获取能力不同,所以对供体植物和受体植物生长产生了不同影响。2.3种主导植物间的竞争优势供体和受体植物地上部磷浓度随培养时间延长显示出不同的变化趋势。统计分析表明,植物生长10周时,受体植物地上部磷浓度比供体植物高出21.1%,且两者差异显著,但在其他时间点两者相近;而供体和受体植物根系磷浓度总体上随时间无明显变化(图5,A、B)。试验结果表明,作为提供接种源的供体植物通过菌丝网络能够获取更多的养分资源(磷),从而保持在群落中的竞争优势。当然,在供体和受体植物竞争过程中,时间效应是不能忽视的。供体和受体植物通过菌丝网络建立直接联系之前,供体植物已通过菌根共生体获取了更多的养分资源并形成个体优势,这种“先入为主”的态势在后续的竞争格局中也保持了下来。联系到植物生长后期供体和受体植物菌根侵染率已趋于一致,并且受体室菌丝密度也趋于稳定,可以推测供体和受体植物由菌丝网络获益是不均等的。这也暗示菌根侵染状况并不能很好地反映植物生长对菌根共生体的依赖程度。此外,图5,C、D显示,在系统养分资源总量固定的情况下,介导植物分享了部分资源,从而显著降低了供体和受体紫花苜蓿地上部磷浓度。与对照处理相比,3种介导植物均导致供体和受体植物地上部磷浓度降低20%左右。在介导植物为独行菜情况下,供体和受体植物根系磷浓度明显低于对照和其他介导植物处理,其中供体植物根系磷浓度比对照降低25%,而受体植物根系磷浓度比对照降低16%;供体和受体植物地上部磷浓度在3种介导植物处理间无明显差异。总体上,各处理植株磷浓度在供体和受体植物之间也没有显著差异。以上结果表明,介导植物改变了土壤养分资源在竞争植物之间的分配格局,一定程度上消弱了供体植物的竞争优势。2.4菌根共生结构在间隔室中生长的3种介导植物之中,紫花苜蓿具有较高的侵染率,羊草根系有一定的菌根侵染,而非菌根宿主植物独行菜根内基本观察不到典型菌根共生结构。3种介导植物的生物量以羊草最高,紫花苜蓿次之,独行菜最低,且羊草的根长在3种植物中也最高(表1)。菌根侵染状况可以大体反映菌根共生体对于不同植物的潜在重要性,而植物生物量则能够反映出植物自身的养分资源获取能力。代表禾本科植物的羊草,具有发达的根系,自身具有很强的养分获取能力,所以在3种植物中生物量最高,这是禾本科植物具有广谱生态适应性的主要原因。3植物根系间及其相互作用菌根共生体根外菌丝网络在连接不同植物传递物质与信息的同时,也可以作为良好的次生接种体。本研究结果表明,丛枝菌根真菌在短期内(<8周)能够跨过4cm间隔区,对受体植物形成侵染,从而形成菌丝网络。在10周内,受体植物菌根侵染率即达到和供体植物基本一致。在本试验条件下,供体植物得益于先期形成菌根共生体系而相比受体植物表现出明显的养分资源获取和生长优势。虽然不同介导植物没有显著影响供体室和受体室菌丝网络的形成,但却影响到供体室和受体室中植物的生长和磷吸收。试验表明丛枝菌根真菌菌丝网络具有调节植物间资源分配和影响生态系统结构的潜在作用。紫花苜蓿能够与丛枝菌根真菌形成良好共生,也是菌根效应机理研究的模式植物之一。本研究中丛枝菌根真菌与供体室紫花苜蓿形成良好共生后,根外菌丝体可扩展跨越间隔室,侵染受体植物根系而建立起不同植物根系之间的菌丝连接,这与Giovannetti等证实根外菌丝可长距离伸展并成功侵染其他植物相一致。菌根真菌与植物根系的共培养时间影响菌根真菌的侵染强度。由于供体室植物根外菌丝到达受体室需要一定的时间,在培养第8周时,受体室侵染率显著低于供体室(图2),而到第10周时,供体和受体植物菌根侵染率已无显著差异,表明受体植物已经形成了稳定侵染。紫花苜蓿的生长状况与菌根真菌侵染过程密切相关,供体室和受体室植物生长表现出明显的差异,且这种差异随时间而加大,该结果与Facelli等发现菌根增强红三叶草(TrifoliumsubterraneumL.)种内竞争的不对称性相一致。在植物生长初期,菌根真菌能够促进所有幼苗的生长发育和存活率的提高,但随着植株的不断生长,对资源的需求递增,导致种内竞争强度增大,而与菌根共生早的供体室植物具有更强的竞争优势,因此菌根表现出了增大植物种群间个体大小差异的现象。本研究中3种介导植物羊草