酶催化大豆分离蛋白降解的研究

酶催化大豆分离蛋白降解的研究

与完全蛋白质相比，蛋白质亲水物质的可溶性、稳定性和抗沉淀性得到了显著改善。同时，许多食品的味道明显不适用于表面处理，这限制了蛋白质亲水产品的广泛应用。大豆蛋白水解产物的组成与风味品质直接取决于参与水解的酶的种类及性质。研究发现霉菌发酵大豆蛋白得到的大豆多肽不具有通常蛋白水解产物特有的苦味或腥味。早在20世纪70年代,日本研究者就利用这一特点用曲霉蛋白酶和羧肽酶去除大豆蛋白水解产物的苦味和腥味。苦味理论和苦味肽的结构的研究揭示了苦味形成的机理,影响多肽苦味大小的关键因素,即肽链羧基末端的疏水性氨基酸和氨基末端的碱性氨基酸。外肽酶的脱苦机制在于它们能够从肽链末端逐个切除致苦氨基酸。本课题组一直致力于毛霉蛋白酶及其脱苦作用的研究,发现毛霉蛋白酶的抽提液在中性条件下对大豆蛋白水解产物有很好的脱苦效果,此时有丰富的羧肽酶和氨肽酶存在,但毛霉蛋白酶的活力较低,在实际的应用中受到了一定的限制。进一步的研究发现,根霉能产生很强的酸性蛋白酶,前期研究表明根霉蛋白酶也能催化大豆分离蛋白降解生成无苦味的水解液,因此本文详细地研究了酸性条件下2种霉菌的催化特性。1材料和方法1.1gosporus和培养基雅致放射毛霉(Actinomucorelegans,AS3.2778)、少孢根霉(Rhizopusoligosporus,Rh3152),购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。低温脱脂豆粕粉,山东新嘉华公司;标准蛋白系列,Bio-Rad(上海);干酪素,上海博奥生物科技有限公司。斜面培养基:均采用PDA培养基。固体发酵培养基:10g麸皮(加水比例1:1),装于250mL三角瓶中,灭菌后备用(培养基灭菌条件均为121℃,20min)。1.2试剂的选择浓H2SO4、硼酸、酪氨酸、TCA、NaOH、CuSO4、K2SO4、甲基红、溴甲酚绿、福林酚、β-巯基乙醇、考马斯亮蓝、单体聚丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、Tris,除福林酚试剂自配外,其余均为分析纯。1.3干燥器、消化炉MettlerToledo分析天平;HH-2数显恒温水浴锅;CHRIST冷冻干燥器;HIMACCR22G冷冻离心机;DYCZ-30型电泳仪;HYP-1014消化炉;KDN-102C定氮仪;雷磁PHS-3CpH计等。1.4方法1.4.1蛋白凝乳的制备脱脂大豆豆粕按1:10料液比加入去离子水充分溶解,用2mol/LNaOH溶液调pH至8.0,室温下低速搅拌2h,离心30min弃去沉淀。上清液用2mol/LHCl溶液调节至pH至4.5,离心20min弃去上清液,得到蛋白凝乳。经水洗后,加水并用2mol/LNaOH溶液调回至pH7.5,搅拌均匀,4℃透析36h。冷冻干燥后即为大豆分离蛋白。1.4.2elegns/osgeis培养在固态发酵培养基中接种1mL菌悬液(孢子数约为106个),摇匀,放人霉菌培养箱中培养(A.elegans培养温度28℃、相对湿度65%～75%、时间48h;R.oligosporus培养温度32℃、相对湿度65%～75%、时间48h)按干曲10倍体积加无菌水,分散均匀,4℃下浸提过夜。8层无菌纱布过滤,将滤液冷冻离心,得到的上清液即为粗酶液。1.4.3dmin内的膜活性酶活力采用GB10317-1999Folin-酚法。酶活力定义为:在40℃,一定pH条件下,1min内催化酪蛋白水解产生1μg酪氨酸所需的酶量为1个蛋白酶活力单位(U)。由Folin-酚法得到酪氨酸标准曲线如图1所示。1.4.4大豆分离蛋白的制备称取适量蛋白5等份,分别溶解于pH3.0、3.5、5.0、5.5和6.0的缓冲液中,室温搅拌2h,95℃中预热处理15min,冰水浴冷却到室温,再次调整到相应的pH。然后按照酶与底物比600U/g加入肽酶酶液,配制成浓度为1%的大豆分离蛋白溶液,不足体积用缓冲液补齐。50℃保温反应4h,期间间隔取样(即0min、30min、1h、2h、3h、4h),置于沸水浴中20min,冰水浴冷却后,调节pH至6.5,冷冻离心30min,取上清液,4℃备用。1.4.5水提取物的测定参照国标NY/T1205-2006测定样品的水溶性蛋白含量。大豆分离蛋白及水解产物蛋白质含量(N×6.25)。1.4.6溶解指数的测定三氯乙酸可以沉淀蛋白质和大的肽段,对于特定的底物,三氯乙酸可以定性地反映蛋白质的分解情况,溶解指数越高,表明较短肽链的含量也越高。样品的酸溶蛋白含量根据国标QB/T2653-2004测定。1.4.7sds-gas产品采用Leammli系统。分离胶浓度为14%,浓缩胶浓度为5%,上样量为10μL。2结果与分析2.1毛霉蛋白酶活力变化雅致放射毛霉和少孢根霉分别在各自最佳温度、湿度条件下培养48h,所得粗酶液在相应各pH条件下蛋白酶活力见图2。从图2可以看出,在酸性范围内,随着pH值的增高,雅致放射毛霉蛋白酶活力呈直线上升趋势。少孢根霉蛋白酶活力起初高于毛霉蛋白酶活力,但其呈现先上升后下降的趋势,在pH5.0和5.5时较高,当pH6.0时急剧下降且活力值开始低于毛霉蛋白酶的。这主要是因为毛霉能够产生酸性、中性、碱性蛋白酶,在培养到48h左右时,酸性和中性蛋白酶达到最高活力且pH6.0时活力最强、最稳定。而少孢根霉则主要产酸性蛋白酶。所以,从总体来看,少孢根霉产酸性蛋白酶的能力比毛霉的强。2.2种霉菌蛋白酶ph值对spi表达的影响根据1.4所述的各方法,分别用毛霉和根霉蛋白酶对SPI进行水解,并对其降解产物中的水溶性蛋白含量、水解度等指标进行了分析,结果如表1所示。随着酶解反应的进行,蛋白质肽链被切成大小不等的片段,使得水溶蛋白含量呈现不同程度的增加。水解度可以反映酸性条件下总的蛋白水解酶类(即酸性或中性蛋白酶、羧肽酶、氨肽酶等)的活力。从表1数值可以看出,雅致放射毛霉蛋白酶对SPI的水解度总体上随pH值的增大而增大,并且酸性范围不同,增大的幅度具有明显差异。在pH3.0、pH3.5的极酸性条件下,水解度极低,基本在10%以下;在pH5.0、pH5.5中性偏酸性范围内,水解度逐步上升到30%～40%;而当pH值为6.0即接近中性条件时水解度急剧增大,达到60%以上。同时,水溶性蛋白的含量也在随着水解度的增大而增加。少孢根霉蛋白酶水解产物中水溶性蛋白含量增长趋势同毛霉的一样,但在pH5.0～6.0,其水溶性蛋白的得率始终比毛霉蛋白酶的低10%左右。根霉蛋白酶的水解度在pH值为3.0～5.0,均保持在20%～30%,pH值达到5.5时开始急剧上升,pH6.0时达到最大值。苦味品尝结果显示,在酸性条件下,2种霉菌蛋白酶催化SPI降解产物苦味均不明显或无苦味。所以,从水溶蛋白含量及水解度来分析,2种霉菌蛋白酶水解产物水溶性蛋白含量及水解度均随着pH值的升高而增大,毛霉蛋白酶水溶性蛋白得率较高,少孢根霉蛋白酶的水解度较高。2.3u3000酸/碱分别降解酸性亚基为了考察毛霉和根霉蛋白酶催化SPI降解的具体过程,分别对两种霉菌蛋白酶酶解过程中不同时间段所取的样品进行Leammli系统电泳分析,所得SDS图谱如图3所示。由图3可以看出,pH3.0时,A.elegans和R.oligosporus蛋白酶对SPI的水解能力都很强,二者没有明显的区别,在水解1h的时候SPI的β-伴球蛋白(7S)条带消失,球蛋白(11S)的碱性性亚基的条带也都基本消失。但是在pH3.5时,R.oLigosporus的酸性内肽酶水解能力比A.elegans略强些,在水解2h处,11S的酸性亚基已完全被水解,但A.elegans对应的11S酸性亚基还没有完全水解。总之,在极酸性条件下,A.elegans和R.oligosporu蛋白酶对SPI的水解能力都很强,表明此时二者的主要作用酶都为酸性蛋白酶。只是R.oligosporus蛋白酶使大分子蛋白变为小分子肽的能力更强些。在pH5.0～6.0中偏酸性条件下,A.elegans和R.oligosporus对SPI的水解强度呈现较大差别。A.elegans蛋白酶水解强度随着pH值的增大而增强,pH值5.0时,11s酸性亚基消失需要4h左右,而pH6.0时只需2h。但与pH3.0、pH3.5的情况相比较,此酸性范围条件下各个亚基降解消失的速度下降,同时伴随有新的条带产生,特别是碱性亚基几乎不能在4h内降解;R.oligosporus蛋白酶催化下的SPI在pH5.0、pH5.5时各个亚基降解消失的速度还比较快,碱性亚基可以在4h内降解,但是当pH6.0时则明显下降,酸性亚基和碱性亚基均不能在4h内消失。表明R.oligosporus的催化作用以酸性蛋白酶为主,当pH接近中性时催化能力下降。结合表1中水溶蛋白含量及水解度的分析结果可以看出,A.elegans和R.oligosporus的蛋白水解酶类包含了内肽酶和外肽酶,在pH3.0、pH3.5的条件下,酸性蛋白酶(内肽酶)活力很强,因此可以快速地将肽链打断成为小分子,使电泳图谱是的各个条带迅速地消失,但此时水溶性蛋白和水解度并不高,在pH升高到5.0、5.5、6.0时,内肽酶活力减弱,外肽酶活力增强,因此大分子蛋白条带逐渐消失、新的条带出现并随着水解进程而消失,此时,由于大量小肽和氨基酸的生成导致水溶性蛋白和水解度的增加,但两个霉菌蛋白酶在酸性条件下其内肽酶和外肽酶的比例关系随pH的变化有较为明显的差异。3ph对毛霉和根霉蛋白酶水解大豆分离蛋白的影响(1)在偏酸性条件下,R.oligosporus产酸性蛋白酶的能力比A.elegans的强。(2)在pH3.0和pH3.5的条件下,毛霉和根霉蛋白酶都能迅速地催化大豆7S和11S蛋白的降解,但此时水溶性蛋白的得率不高,均在35%以下;在pH5.0、5.5和6.0时,毛霉和根霉蛋白酶催化大豆分离蛋