棱镜毒抗补体蛋白araseb对补体激活致急性肺损伤的保护作用

棱镜毒抗补体蛋白araseb对补体激活致急性肺损伤的保护作用

急性肺损伤（ali）是指由心源性以外的各种肺内部和外部因素引起的急性和周期性肺损伤。ALI发病早期,补体系统首先被激活,补体活化片段C5a、C3a或攻膜复合物(Membraneattackcomplex,MAC)介导吞噬细胞吞噬、增加血管通透性及趋化性以及介导炎症应答等,总补体活性明显降低,中性粒细胞在肺血管内聚集。眼镜蛇毒因子(Cobravenomfactor,CVF)是一种来源于眼镜蛇毒的补体激活蛋白,CVF在血清中可与B因子形成具有C3/C5转化酶活性的CVFBb,从而激活补体替代途径,产生大量C3a、C5a。因此采用静脉给予CVF可模拟补体激活导致的急性肺损伤。AtraseB是从中华眼镜蛇毒中纯化出的一个新的抗补体蛋白,可抑制补体激活。本文应用CVF诱导的急性肺损伤模型,评估抗补体蛋白AtraseB防治急性肺损伤的作用。1材料和方法1.1抗补体蛋白凝胶层析抗补体电泳AtraseB是从中华眼镜蛇毒中纯化出的一个新的抗补体蛋白。中华眼镜蛇毒粗毒通过SPSephadexC-25阳离子交换层析,收集活性峰,经HiTrapHeparinHP柱亲和层析,收集活性峰再经HiTrapQHP柱阴离子交换层析和HiTrapSPHP柱阳离子交换层析,得到SDS电泳为一条带的抗补体蛋白AtraseB,经BCA法蛋白定量后冻存备用。1.2实验动物雄性SD大鼠24只,体重210～250g,由第三军医大学附属医院实验动物中心提供,合格证号SCXK(渝)2007-0005。所有的操作和实验流程均遵守《实验动物管理条例》。试验环境:室温22℃～25℃,湿度60%～70%。动物在实验前均自由进食和进水。1.3adl和tnf-elisa试验剂盒CVF的制备和抗补体活性参照文献;大鼠IL-8、ICAM-1、TNF-αELISA试剂盒为美国ADL产品;髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)试剂盒购于南京建成生物工程公司;BCA蛋白定量试剂盒购于碧云天生物技术研究所。1.4血清balf法大鼠随机分3组:对照组、模型组和给药组,尾静脉给予AtraseB3.4mg/kg,其余两组给等体积VB缓冲液。给药后2h麻醉大鼠,舌下静脉给予CVF50U/kg造模,对照组给予等体积的VB缓冲液。造模后50min,打开腹腔下腔静脉取血,制备血清;开胸腔结扎右肺,暴露气管行气管插管,用5ml生理盐水分3次进行支气管肺泡灌洗,得支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolarlavagefluid,BALF),回收率达90%。BALF行细胞计数后,以3000rpm离心10min,取上清液,分装,-80℃冻存备用,TNF-α、IL-8、ICAM-1、蛋白含量的测定按试剂盒说明书进行。称取右肺重量,根据(右肺重量/大鼠体重)公式,计算右肺系数。右肺上叶取出后马上于-80℃冷冻备用,用于MPO测定,具体方法按试剂盒说明书进行。右中肺叶以80℃烘烤至恒重,根据(湿重-干重)/湿重公式,计算肺水含量。右下肺叶用中性福尔马林固定,行病理切片检查。2结果2.1两组barf细胞总数和mpo含量比较结果显示,AtraseB可明显降低BALF细胞总数和MPO含量,其肺系数、肺含水量、BALF蛋白含量与模型组比较没有统计学意义,见表1。2.2血液中的这种运动影响着cinf、icam-1和il-8结果表明,与模型组比较,样品组BALF中TNF-α、ICAM-1含量显著降低,而IL-8含量无显著差异,见表2。2.3不同模型组不同组织学检测病理切片结果显示,模型组肺泡腔内见较多炎症细胞浸润,毛细管腔内见较多微血栓形成,肺间质血管明显扩张充血,较多炎细胞浸润(图1A、B)。样品组少部分肺泡腔内见少量炎细胞浸润,少部分毛细血管腔内见微血栓形成,肺间质血管轻度扩张充血,少量炎细胞浸润(图1C、D)。A:模型组,可见大量中性粒细胞肺浸润;B:模型组,可见毛细血管中较多微血栓形成;C:AtraseB组,可见少量中性粒细胞浸润;D:AtraseB组,可见少部分毛细血管中有微血栓形成。3抗ba抑制实验检测中性细胞聚集,减轻肺损伤和微血栓形成本实验结果显示,AtraseB可明显减少中性粒细胞在肺血管内聚集,显著降低炎症因子ICAM-1、TNF-α的含量,有效减轻急性肺损伤的症状。急性肺损伤时,常发生补体系统的活化和肺小血管中大量中性粒细胞聚集。在肺血管内,C5a与内皮细胞结合可以吸引血流中的中性粒细胞,使之在肺中淤积,中性粒细胞聚集性增加;且中性粒细胞被激活,释放自由基,损伤毛细血管内皮细胞,引起化学性炎症,激活凝血系统、导致血栓形成。运用C5敲除小鼠或给予C5a或C5aR抗体的动物,可有效减轻CVF诱导的肺损伤。实验前给予可溶性补体受体蛋白sCR1可有效降低中性粒细胞在肺血管内聚集。静脉给予AtraseB2h后可使补体下降50%以上(未发表数据)。实验中AtraseB抑制补体激活,有效降低BALF中细胞总数和肺组织中MPO的含量,而MPO是反映中性粒细胞的特征性指标。同时结合病理切片检查结果,共同说明了AtraseB确实抑制了中性粒细胞在肺内聚集。中性粒细胞的活化和聚集能引起大量炎症介质释放(TNF-α、IL-8等),导致肺泡基膜损伤。炎症介质TNF-α、IL-8、粘附分子ICAM-1的释放增加,可进一步诱导炎症细胞与内皮细胞粘附与聚集,从而进入恶性循环,促进炎症,加重肺损伤。在ALI早期,降低中性粒细胞在肺组织聚集,可有效减轻肺损伤。实验中样品组TNF-α、ICAM-1显著低于模型组,说明AtraseB能有效减轻ALI中的炎症反应。综上所述,补体激活和后续的中性粒细胞聚集在肺损