环氧氯丙烷对猪主动脉瓣膜去细胞基质体外酶解影响

2007年023卷第0

·787[摘要]目的:研究环氧氯丙烷对猪主动脉瓣膜去细胞基质体外降解的影响。方法:按实验干预不同,90个去细胞猪瓣叶随机分为胶原酶和弹性蛋白酶组(A组,环氧氯丙烷组(B组,水解对照组(C组)。A组将猪主动脉瓣膜去细胞基质,5%胶原酶和弹性蛋白酶降解;02%环氧氯丙烷预处理后48h,5%胶原酶Ⅰ和弹性蛋白酶体外降解猪主动脉瓣膜去细胞基质C组加入蒸馏水处理;于处理后第3、6、9、1530天观察各组降解失重率、降解液外观、蛋白及羟脯氨酸含量。结果A、B组的支架材料均随降解时间延长逐渐变得菲薄、组织疏松降解液外观变浑浊,瓣膜失重率增加,降解液蛋白含量和羟脯氨酸含量增加(P<01)BA组相比在瓣膜失重率,降解液蛋白含量和羟脯氨酸含量均明显减低,2组上述指标均高于C组(P<01。结论环氧氯丙烷有减缓胶原酶和弹性蛋白酶降解猪主动脉瓣膜去细胞基质的作用。[关键词]主动脉瓣环氧氯丙烷去细胞[中图分类号]R3221[文献标志码]A[文章编号]10011439(2007)100787AffectionofepoxychloropropaneondegradationofacellularporcineaortavalveinvitroGUChunhu WANGYunya ZHOUHuasong WUXiaocheng LIUYangLIUWeiyong ZHAOJinchaoYIDinghua(DepartmentofCardiovascularSurgery,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversityXian,710032,AbstractObjectiveToinvestigatetheaffectionofepoxychloropropaneondegradationofacellularporcineaorticvalveinvitroMethodAccordingtothedifferenttreatment,90acellularporcineaorticvalveswererandomlydividedinto3groups(enzymedegradationgroup,epoxychloropropanegroup,controlgroupTheacellularporcineaorticvalvesofenzymedegradationweredegradationwith05%collagenaseandelastaseEpoxychloropropanegroupweretreatedwith2%epoxychloropropanefor48hbeforedegradationwithenzymedegradation;ControlgroupweretreatedwithwaterThehistomorphology,weightloss,valueofproteinandhydroxyprolinewasobservedat3,6,9,15and30dafterdegradation.ResultEpoxychloropropanegroup,theacellularporcineaorticvalveofenzymegroupbecamepoorer,looserandbrokengraduallyinthancontrolgroup(P<001.Theweightlossofvalve,thevalueofproteinandhydroxyprolineinvehiculuminenzymegroupweresignificantlymore<01ConTatethedegradationofcollagenaseandelastaseinvitro.KeywordsAortavalveEpoxychloropropaneAcellulariseExtracellularma去细胞猪主动脉瓣膜基质作为支架材料,构建组织工程心脏瓣膜的研究成为组织工程瓣膜研究的重要内容。但研究发现去细胞猪瓣在进行腹主,降,基质材料降解明显,而此时受体成纤维细胞产体瓣膜〔1因此有必要对瓣膜去细胞基质材料的降解和降解控制过程进行研究,以期对其在受体内的降解时程加以调控,使其降解过程与受体的自体瓣膜形成过程协调进行、符合应用要求。环氧氯丙

*基金项目:国家自然科学基金项目资助(No30600137,陕西省科技攻关基金[2005K111第四军医大学西京医院心外科(西安,通讯作者易定华,Emailyidh@fmmuedu烷是一种低毒、无毒的环氧交联剂〔2〕,本课题旨在研究环氧氯丙烷对猪主动脉瓣膜去细胞基质体外降解的影响。 11盒等,均购于南京建成公司。胰蛋白酶、EDTA、Ⅰ、,Sigma公司产品。真空干燥机(XIANⅢ型,西安空气压缩机厂)、分析天平(S40型,上海精密仪器厂、紫外可见光分光光度计SH80Ⅰ型,上海光学仪器厂)、恒温箱(400型,西安实验仪·788 JClnCardol(ChnaOc2007,Vol23,No12121杀猪主动脉瓣膜立即置入装有4℃Hank's溶液中。尽量剔去血管外膜,4℃Hank's溶5min3次青霉素50000UL链霉素瓣。Co60照射消毒后4℃下保存备用。122实验分组取制备好的猪主动脉瓣膜基质90个,编号后采用随机数字表法完全随3组(A组环BC,0个样本,样本经真空冻干后置入降解液中。各组分别以5%Ⅰ、05%,28h,mg/m〔51/1,降解实验于37℃恒温箱中进行 。猪主动脉瓣膜基质支架材料于降解后第3、6、9、15和30天,从每组取出6个平行样本进行观察,检测结果以6123形态和结构变化的观察降解试样经常规石蜡包埋组织切片用苏木精伊红染色并用戊二醛固定扫描电子显微镜观察材料结构变化。24燥至恒重称瓣叶干重计算初重量于降解的W,率=(WW1/W100。125降解液蛋白含量和羟脯氨酸含量在降解的不同时间点6、15、30天观察降解液外观浑浊的程度、内容物改变采用考马斯亮蓝试剂盒检测降解液中可溶性蛋白含量。12000g4℃60min。20μl加考马斯亮蓝染液200μl混匀10min用可见光分光光度计在570nm测光吸收值。以空白溶剂为对照牛血清白蛋白0005～006g/L)为标准品绘制标准曲线依据标准曲线推算样品中蛋白含量。同期采用羟脯氨酸试剂盒,550nm1cm光径,蒸馏水调零,测各管吸光度,计算羟脯氨酸含量将降解液10倍后3ml用紫外光谱分析仪分析不同3

出现明显的断裂。B组和C组标本始终未见明显的纤维结构改变图)。电子显微镜下观察结果与光学显微镜下观察的改变类似,A组降解第15天后致密的纤维网状结构明显变得空旷,纤维明显肿胀。B组和C组标本纤维结构始终致密,未见明显的改变图)。①C组A组B 降解第15天3组的组织形态比较①C组A组,③B2153组的超微结构比较(×1223组降解后不同时间降解液外观、、降解液蛋白含量、羟脯氨酸含量变化随降解时间延长,A组降解液逐渐出现浑浊,5天已有明显变化,15天时隐约可见微絮状物,30天时试样纤细菲薄,组及B组降解液在观察过程中始终清亮。降解液样本紫外光谱分析显示,250～290nm吸收波长范围出现吸收峰,且表现出随时间延长,吸光度增大的趋势。该波长范围为蛋白和肽链吸收范围,可见去细胞瓣膜基质在降解过程中逐步降解为可溶性的蛋白肽链结构,且随降解时间延长降解产物不断增多。2

s表示,组间比较采用t检验 3组降解后不同时间失重率、降解液蛋白含量2.3A

菲薄、透明、韧性差、缩小、卷曲。而B组和C组标本始终未见明显的外观改变。A3周边即开始变得疏松,纤维网孔变大,进而降解作用逐渐向标本中央扩散至第15天粗大纤维

3率、良好的细胞黏附性和机械性能等优点,为组织工程心脏瓣膜提供了较为理想的支架材料来源。组织工程支架材料的作用主要是提供种子细胞生长的三维空间在移植后引导受体自身组织的再临床心血管病杂志2007年0月第23卷第0 ·789表 3组降解后不同时间失重率、降解液蛋白含量、羟脯氨酸含量变 x

A组

B组

C组 第3 83210139001815532110410002123810801000104202第6 301692012820624510001170351001518100031610100749022427434909362110021904610026351000415102007315025328745211375130023105451002563100061910100643002642964761278814002411368100185110005112102009C组比较1P<01A组比较,2P<01生,在移植早期发挥被移植组织器官的替代功〔6〕去细胞猪主动脉瓣膜基质的主要成分是Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白,而胶原是一种具有刚性的纤维状蛋白,一般的蛋白酶类难以将其降解。因此,去细胞瓣膜材料在植入受体后所面临的主要降解酶将是胶原酶和弹性蛋白酶等有限的蛋白酶类〔〕。胶原酶,即基质金属蛋白酶中的MMP1、MMP8、MMP13,其作用底物是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原,在体内主要是由成纤维细胞分泌。胶原酶是体内惟一可以特异性降解胶原的蛋白酶,其特点是在胶原三螺旋区的特殊位点上具有切割断链作用。如作用于I型胶原的al链上GlyAa间使其发生断键,或在2链上GyLeu间作用发生断键,从而使肽链断裂,使三螺旋的胶原结构逐步降解为短肽,进而进入细胞内在溶酶体酶的作用下进一步降解为氨基酸,或直接人血,后经尿液排出体外。弹性蛋白酶属丝氨酸蛋白酶家族,存在于体内多种细胞内,如中性粒细胞巨噬细胞血管壁平滑肌细胞等。在机体局部微环境变化时这些细胞即被激活,活化的细胞可释放蛋白水解酶类,弹性蛋白酶是其中含量高作用范围广水解能力较强的酶。对于去细胞基质,弹性蛋白酶除了降解其中的弹性蛋白之外同时也分解胶原纤维连接蛋白等成分,全面作用于去细胞基质的降解8〕。戊二醛作为生物瓣的交联剂, 机械强度增加了,但瓣膜易于钙化和衰坏。同时,胞生长。其后出现的大量新型交联剂如Polyurethane、NoReactTM、Epoxy等均被认为有良好的

交联作用,尤其是Epoxy有逐步取代戊二醛的趋势。本实验结果表明胶原酶和弹性蛋白酶有降解猪主动脉瓣膜去细胞基质的特性,环氧氯丙烷有增强去细胞基质抗酶解的能力根据这一结果,可以改变去细胞基质的降解过程,使其降解速率具有一定的可控性。[[刘维永金振晓顾春虎等.去细胞猪主动脉瓣的构建及性能鉴定J中华医学杂志2005[treatment[J]PolymerDegrStab,2003,8165NEUENSCHWANDERS,HOERSTRUPSP53Heartvalvetissueengineering[J]Transpl3272004,12:359365[蔡开灿,易定华,郑斯宏,等.环氧氯丙烷和TritonX100联合处理猪主动脉瓣的实验研究[J].中华[SCHENKELAYLANDK,VASILEVSKIO,OPIF,etalImpactofdecellularizationofxenogeneicsueonextracellularmatrixintegrityfortissueeng46)36J[顾春虎,刘维永,张近宝,等去细胞猪主动脉瓣膜20108

ofaminoacidsidechainsinacellularizedarteries[J]2094[ CLAUDIAM,VAZA,LEONTINEA,etlIvitrodegradationbehaviourofbiodegradablesoyplasticseffectsofcrosslinkingwithglyoxalandthermal基质制备[J中华实验外科杂