三七hplc指纹图谱的影响因素研究

三七hplc指纹图谱的影响因素研究

中药三七是三七科植物种类的花三七。主产于我国云南、广西,是我国特产的传统珍贵药材。具有散瘀止血、消肿定痛等多种药理和生物活性,它是经典的止血良药,用于咯血、吐血、衄血、便血、崩漏、外伤出血、胸腹刺痛、跌扑肿痛等,熟用补血、和血,用于贫血、虚弱、月经不调等。云南民间认为三七尚有滋补强壮作用。近年来对中药三七的指纹图谱有较多的研究报道,建立了多种三七指纹图谱的分析方法,并且已有人用指纹图谱来区分三七及其混淆品和分析三七药材及制剂。我们课题组也已经建立了简便、快速,重现性良好的中药三七高效液相色谱指纹图谱的分析方法,并运用该方法分析了不同生长年限和不同药用部位的三七样品,较好地反映了这些样品间的差异。三七采挖后在产地一般采用自然干燥方法,但是遇阴雨天时需要烘干,所以在商品中存在晾干(晒干)或烘干的产品。不同的干燥方法对三七化学成分会造成什么影响,体现在指纹图谱上会发生什么变化目前还没有研究报道。因此,作者考察了不同干燥方法三七样品的HPLC指纹谱。另外,新鲜药材在干燥过程中水分逐渐丢失,使干燥过程中药材的含水量不断减少;干燥后的药材在保存过程中由于受到保存环境的温度和湿度等的影响,也会引起药材中含水量的变化,为了考察药材的干燥过程和药材含水量对于指纹图谱有什么样的影响,我们对新鲜和干燥三七药材及干燥过程中的不同阶段的药材进行了HPLC指纹谱研究。为了验证实验结果,我们又让已经干燥的药材吸水、软化,然后测定其HPLC指纹谱,力求阐明药材干燥程度对指纹图谱的影响规律。另外三七商品有整三七(个子药材)、三七片、三七粉等不同状态,在保存过程中其质量是否会发生变化,若有变化又会对指纹图谱产生什么样的影响呢?为解决这些问题,作者分别观察了三七整主根(个子药材)、主根切片(三七片)和主根粉末(三七粉)这三种状态药材的指纹图谱,并对结果进行了分析研究。1仪器、药品和药品AgilentHP1100高效液相色谱仪,DAD检测器;旋转蒸发仪RE-52A(上海亚荣生化仪器厂);超声波清洗器(北京医疗设备二厂,功率100～250W可调);FW80型微型高速万能试样粉碎机(天津泰斯特公司);SHZ-3(Ⅲ)型循环水多用真空泵;202-2BS型电热恒温干燥箱(天津市华北实验仪器有限公司,功率2.0kW)。甲醇(分析纯);甲醇、乙腈(色谱纯,美国Fisher公司);双蒸水。三七成分对照品:三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和Re、人参皂苷Rb1、和人参皂苷Rd均购自吉林大学基础医学院有机教研室;三七皂苷R4、三七皂苷Fa和三七皂苷Fc均由日本富山医科药科大学和汉药研究所小松かっ子教授提供。三七药材见表1,包括云南省7个产地的约250个个体的2～3年生三七,由北京大学药学院生药研究室蔡少青教授鉴定为Panaxnotoginseng(Burk)F.H.Chen。取样时,每个编号的药材样品取主根10头左右进行粉碎、提取和分析,平行操作两份。色谱柱:Luna5μC18(250×4.6mm),流动相:乙腈-水梯度洗脱,梯度设置见表2,流速1.0ml/min,检测波长200nm。3实验方法3.1干燥药材高效液相色谱分析取新鲜采集的药材三七全根(编号为2649、Y01028、0208001、0208002、0208009、030101、030102),去除根茎、侧根、须根及全根根尖得整主根,各编号的整主根再分别分成整主根(整三七)和主根切片(三七片)两种状态,并分别采用阴干和烘干方式进行干燥,对所得干燥药材分别进行高效液相色谱分析。3.1.1切3.1.2干燥3.1.3尹干3.1.4干燥样品溶液的制备方法3.2hplc分析分别取编号为0208015、030109和030112三份样品的新鲜三七药材的整主根在室温下阴干并分别取新鲜、干燥过程中和完全干燥的药材按下列方法制成样品液后进行HPLC指纹图谱分析。3.2.1测定失重情况的确定取新鲜的三七主根7～9头,整体称重记录。将已称重的药材在室温下干燥,监测干燥过程中的失重情况,按照失重的比例换算成鲜材的质量,仍然按鲜材比溶剂为2/25的比例加入溶剂(V2)进行提取。如干燥过程中的药材质量为Y克,比鲜材失重a%,利用X/V1=[Y/(1-a%)]/V2=2/25的关系式计算出V2,进行提取。3.2.3干燥样品溶液的制备方法见“3.1.4”项下。3.2.4相对峰面积的计算软化后的药材取7～9头,按照增重的比例换算成干燥药材的质量,按干燥药材比溶剂为1/25加入溶剂(V3)进行提取。如软化后药材质量为Z克,比干燥药材增重b%,利用[Z/(1+b%)]/V3=1/25的关系式计算出V3,进行提取。为了较为客观地反映不同干燥程度药材之间量的关系,我们引入了计算相对峰面积的数据处理方法。选取S峰(2号峰人参皂苷Rg1+Re,保留时间为15.8～16.2min)作为参照峰,某一色谱峰的峰面积与它的峰面积的比值即为该色谱峰的相对峰面积。计算公式为:AR=Ai/As,AR表示某一色谱峰的相对峰面积,Ai表示某一色谱峰的面积,As表示参照峰的面积。相对峰面积的引入有利于对取样量不完全相同时不同样品间对应色谱峰的响应强度的比较。3.3样品的制备方法将新鲜采集的样品(020001)若干头主根随机分成3组,对其中1组进行切片,为三七片药材组,另2组不切片,作为整三七。三七片与整三七均在室温环境(相对湿度30%)下阴干。阴干的2组整三七,取其中1组粉碎成粉末,过40目筛,作为三七粉组。将干燥后的主根三七片、整三七、三七粉样品分别置于棕色广口瓶中,室温保存。分别于保存0,10,20,30d(1个月)、2个月、4个月、6个月、12个月后进行取样分析。取样方法:①整三七:随机取整三七样品7～9头(约10～14g),粉碎,过40目筛。②三七片:随机取三七片样品约10～14g,粉碎,过40目筛。③三七粉:将三七粉末混合均匀。①～③组样品均分别精密称取粉末1g,平行两份取样,分别按“3.1.4”项下方法制备样品液。4香辛料参数对客观范围内人参皂苷的影响空白实验表明干扰杂质的色谱峰峰高均低于100mAU,不会对样品测定造成干扰。经过方法学验证,证明本论文的色谱学方法有良好的重现性,所考察的色谱峰的保留时间RSD在1%以下,峰面积RSD在5%以下。本文中所涉及的重要色谱峰以数字编号,并以标准品对照,其在各样品中的保留时间(tR)分别在下列范围内:1号(三七皂苷R1,14.6～14.9min),2号(人参皂苷Rg1+Re,15.8～16.2min),3号(三七皂苷R4,21.5～22.0min),4号(三七皂苷Fa,21.6～22.5min),5号(人参皂苷Rb1,22.8～23.4min),6号(三七皂苷Fc,23.7～24.4min),7号(24.5～25.4min),8号(24.8～25.5min),9号(人参皂苷Rd,25.7～26.2min),10号(36.2～36.6min),11号(42.9～43.3min),12号(43.2～43.8min),13号(46.2～46.7min),14号(48.0～48.4min),15号(49.3～50.5min),16号(51.4～52.1min),17号(53.5～55.0min),18号(55.0～56.4min),19号(56.5～57.6min),20号(58.4～59.3min)。4.1峰面积值分布于整主根不同的干燥方法下得到的色谱图见图1～4。干燥方法对三七指纹图谱的峰数没有影响,对三七中不同的组分峰面积的影响不同,如表3中所示,大致包括以下几种情况:(1)1号(三七皂苷R1)、6号(三七皂苷Fc)、13号、16号组分不论是切片状态或者整主根状态均在阴干条件下峰面积值高于烘干条件下的峰面积,且这4个峰在整主根阴干时均有最大的峰面积,其中13号色谱峰在整主根状态下的峰面积值均高于切片状态的峰面积,而16号色谱峰烘干条件下,整主根状态有高于或近等于切片状态的峰面积值。(2)7号和9号(人参皂苷Rd)组分整主根在烘干条件下峰面积值高于阴干条件下的峰面积;切片状态在烘干条件下峰面积值高于或近等于阴干条件下的峰面积值。9号色谱峰在切片状态下烘干的峰面积值还高于整主根状态下烘干和阴干的峰面积。(3)3号(三七皂苷R4)、4号(三七皂苷Fa)和5号(人参皂苷Rb1)色谱峰在阴干和烘干两种条件下,及12号色谱峰在阴干条件下,切片峰面积值均高于整主根的峰面积值;12号色谱峰在烘干条件下,切片峰面积值高于或近等于整主根的峰面积值。(4)8号、10号、17号、18号、19号、20号色谱峰整主根状态下烘干和阴干的峰面积值均分别高于切片烘干和阴干的峰面积值。且18号和19号色谱峰在整主根状态下(无论烘干还是阴干)的峰面积均高于切片状态下(无论烘干还是阴干)的峰面积值。4.2皂苷类成分分析新鲜药材与干燥药材相比[图5～7分别代表新鲜药材、干燥过程中的药材(失重约30%)、干燥后药材(失重约60%)的指纹图谱],保留时间在30min以前的色谱峰在数目和强度上都没有明显的差异,新鲜药材的15号色谱峰(保留时间49.2～49.7min)响应很高,其强度超过了13号和16号色谱峰。在干燥过程中,15号色谱峰强度逐渐下降,而13号和16号色谱峰强度则逐渐升高。13号、15号和16号色谱峰的紫外图谱表明它们均具有皂苷类成分特征。药材完全干燥以后,15号色谱峰的响应很低,峰面积的积分值小于50,低于最小检测面积,以S峰(2号峰)为参照峰的相对峰面积约为0.2%,而新鲜和失重在30%左右的药材中,相对峰面积在12.7%～28.1%之间,峰强度相差60～140倍,同时,在干燥过程中,55min以后的极性较小的18号和19号色谱峰相对峰面积也逐渐增大。15号色谱峰在软化药材(见图8,软化药材比干燥药材增重约30%)中又有明显大于干燥药材的相对峰面积值,达到了0.7%～1.4%;而13号、16号、18号和19号峰在软化药材中又明显小于干燥药材中的相对峰面积,可见药材由新鲜到干燥所发生的变化是部分可逆的。因此可以认为15号色谱峰是新鲜主根和含水主根的特征峰。表4给出了这13号、15号、16号、18号和19号5个色谱峰的相对峰面积变化情况。4.3不同保存状态样品的色谱峰面积变化不同状态的三七药材在保存过程中色谱峰绝对峰面积的变化规律有如下相同点:(1)10号色谱峰和12号色谱峰的峰面积随着保存时间的延长而逐渐升高。(2)3、6、7、8、11、13、18、19和20号色谱峰峰面积随着保存时间的延长而逐渐降低。(3)1号色谱峰的峰面积在保存过程中变化相对较小。其中10号和12号色谱峰峰面积的增高是保存中最特征的变化。以粉末保存为例,图9、10、11和12分别是粉末药材保存0天、30天、2个月和6个月的指纹图谱,将保存过程中10号和12号色谱峰的峰面积随保存时间的变化用图13中的折线图来表示,可以看出两个峰的峰面积持续上升,其紫外图谱显示10号色谱峰具皂苷类成分特征,而12号色谱峰未显示皂苷类成分特征。不同状态的三七在保存过程中的峰面积变化又有不相同的地方,表5中列出了以粉末、三七片和整三七不同状态的三七样品分别在保存0天、2个月、4个月、6个月和12个月时的峰面积值,并计算了色谱峰在保存12个月时比保存0天时峰面积增加的数值。由表5中的结果我们可以发现:(1)第10和12号色谱峰峰面积增加,这在不同保存状态的样品中是一致的。(2)以粉末保存时,1号和5号色谱峰在12个月内的峰面积值变化较小,组分在保存过程中基本稳定;三七片状态下1号、2号、9号和17号色谱峰在保存中变化较小;整三七状态下1号、4号、5号、9号、13号、16号和17号色谱峰在保存过程中变化较小。状态越完整,保存中变化小,比较稳定的色谱峰就越多。(3)三七片和整三七状态的样品在不同保存期的峰面积数值有上下波动,而粉末状态的样品峰面积数值变化方向稳定。5存时间对三组hplc指纹图谱的影响本文考察了三七药材的干燥方法、干燥程度及保存时间对三七HPLC指纹图谱的影响,找到了一些规律性变化,得到以下结论,这些结论对于利用指纹谱鉴别和控制三七药材质量有着实际意义。5.1干燥配方的影响5.1.1烘干使一些组分峰面积降低,切片干燥亦使得组分峰面积降低。1号、6号、13号和16号色谱峰无论是切片状态或是整主根状态在阴干条件下峰面积值均高于烘干条件下的峰面积值,说明干燥温度对组分的影响较大,高温干燥造成这4个组分的峰面积降低。这4个色谱峰在阴干的整主根中有最大的峰面积值,说明这4个组分的峰面积不但受到温度的影响,而且受到药材状态完整性的影响,尤其是对于13号和16号组分来说,三七整主根药材干燥比切片干燥更有利于其组分峰面积的保持。5.1.2烘干使得一些组分峰面积升高。7号和9号色谱峰在整主根(整三七)烘干样品中的峰面积高于阴干样品,在切片烘干样品中的峰面积高于或近等于阴干样品。其中9号峰为人参皂苷Rd,是一种原人参二醇型三糖苷,它的峰面积增加是否由于三七中含有的原人参二醇型四糖皂苷或五糖皂苷受热后降解造成的,有待研究。5.1.3切片干燥使一些组分峰面积升高。3、4、5、12号色谱峰在三七片中的峰面积高于在整主根中的峰面积。这可能是由于切片使得药材的内部暴露在空气中,促使某些成分发生降解或转化,从而生成了相应的产物,使得3、4、5、12号色谱峰峰面积增加。5.1.4保留时间在45min以后的17、18、19、20号色谱峰在整三七中的峰面积高于在三七片中的峰面积。这可能是由于完整药材的内部组织未被暴露,而有利于17、18、19和20号色谱峰这样的低极性组分含量的保持,而切片药材则相反。因此若要减少三七中低极性成分的损失,应采用以完整主根进行阴干的方法干燥三七药材为宜。而以何种干燥方法进行干燥以使三七各化学成分具有适当的比例关系,需用药效评价方法最终确定。5.2相对峰面积和峰强度5.2.1我们发现了新鲜药材的特征色谱峰为15号色谱峰。药材完全干燥以后,15号色谱峰的响应很低,峰面积的积分值小于50,低于最小检测面积,相对峰面积约为0.2%,而新鲜药材和失重约30%的药材中,其相对峰面积在12.7%～28.1%之间,峰强度相差60～140倍,在软化药材中相对峰面积又回升到了0.7%～1.4%。第15号色谱峰的相对峰面积可以用作判断药材含水量的多少的参考,在药材干燥和加工过程中具有鉴别意义。5.2.2干燥过程中随着药材含水量的减少,13、16、18、19号组分的相对峰面积明显较其他成分的相对峰面积增加。5.3色谱峰峰面积随时间的变化5.3.110号色谱峰和12号色谱峰的峰面积随着保存时间的延长而逐渐升高。原因可能是在保存过程中其他性质不稳定的组分发生了降解,生成上述产物,使得10号和12号色谱峰峰面积增加。5.3.23号、6号、7号、8号、11号、13号、18号、19号和20号色谱峰峰面积随着保存时间的延长而逐渐降低。这些组分大部分的保留时间位于45min之后,是一些极性较低的成分,随着保存时间的延长这些组分峰面积降低,可能与这些组分容易挥发损失有关。5.3.3不同状态的三七在保存过程中,粉末中各个组分的变化幅度较大,三七片和整三七的变化幅度较小。推测这是由于整三七样品结构完整没有经过切片或者粉碎,组分相应的变化在整三七中速度较慢。所以为了保持三七化学成分的稳定,宜以整主根的状态来长期保存三七药材。2七样品液的制备用刀片将新鲜三七整主根(个子药材)横切成厚约0.1～0.2cm的薄片(横向切片可减少在分析药材时由于切片中皮部和木质部比例的不同而造成取样的不均匀性)。在烘箱中烘干,温度控制在35.0±1.0℃。从手感药材干燥(约需4～5d)后开始,每隔12h称重1