代谢组学与中医证候研究

代谢组学与中医证候研究

作为中医学独特的识病方法，该综合征是中医辩证法的基础和精髓，也是中医理论、法律和法规的桥梁和关键。其实质是人体在疾病发生、发展过程中某一阶段病理生理状态的概括。目前中医疾病证候辨证标准的建立方法为首先获取辨证信息,然后通过统计学方法或专业知识判断等方法建立辨证标准,最后检验辨证标准。虽在研究方法上取得了一定的进展,但缺乏实质性的突破。而代谢组学以其系统性、动态性、综合性等特点与中医证候的整体观、恒动观、辨证观思维模式有异曲同工之妙。代谢组学以代谢物群体作为标志物来诊断疾病,使得中医证候客观化、科学化得到了方法学和技术上的支持。因此,将代谢组学方法与技术引入中医证候本质研究具有重要的现实意义。1研究对象的特殊性代谢组学是系统生物学的重要组成部分,是“在新陈代谢的动态进程中,系统研究代谢产物的变化规律,揭示机体生命活动代谢本质”的一门科学。代谢组学强调把人体作为一个完整的系统来研究,通过测定人体各种体液内代谢物的组成变化来认识和反映人体代谢网络在疾病和药物作用下的变化规律,与中医学的整体观思维非常契合。中医的证是对疾病某一阶段的特定病理生理过程的认识,是机体内因和环境外因综合作用下的整体状态,并随着病程发展而发生相应的变化。而代谢组学的研究对象不是针对细胞、组织、体液某一时间点,而是生命个体对外源性物质的刺激、环境变化或遗传修饰所做出的所有代谢应答的全貌和动态变化过程,两者的研究均具有恒动观思维。证不仅对疾病中致病因素这一共性有深刻的认识,更注重不同机体的反应性,即注重辨证。代谢组学也认识到这种个体差异,在某一病证相关特定组分的共性加以分析、判断的同时,又重视差异(发现疾病的生物标志物),即代谢组学亦具有辨证性。利用代谢组学研究中医证候摆脱了西方还原论的束缚,从整体层面分析中医证候的特点,反映中医证候的内涵,高通量及无歧视的成分分析能够快速解决中医证候主观对信息歧视的问题,使中医证候本质客观化。2中医证候研究中医治病讲求辨证论治,而采用代谢组学技术研究不同证型、不同时间患者血液、体液中代谢物进而确定证型所对应的代谢组学特征和证候的物质基础,使证得以科学化、客观化、定量化的描述,不仅能提高中医药的临床治疗效果,更能促进中医证候本质的研究。2.1基于临床疾病综合征的代谢研究2.2人类代谢的变化与人类代谢的变革亚健康是人体处于健康与疾病之间的一种状态。研究亚健康形成过程中机体代谢及其代谢物的变化,探索潜在的生物标志物,进而了解亚健康的发生机制,有助于进行亚健康的早期诊断与干预。3中医证候学生物标记物和代谢轮廓构建符合中医证候的病证结合动物模型,采用代谢组学技术对其生物样本进行研究,找到中医证候的生物标记物和代谢轮廓,进而探究其作用机制,有利于进一步阐明中医证候的本质并应用于临床诊疗。3.1ca、pls评分简维雄等采用结扎大鼠冠状动脉左前降支复制急性心肌梗死心血瘀阻证模型,并应用GS-MS技术结合PCA、PLS分析模型组大鼠心肌组织代谢产物发现,大鼠急性心肌梗死心血瘀阻证与心肌组织代谢产物苹果酸、谷氨酸、酪氨酸等含量的改变密切相关。心肌组织代谢产物谱显示急性心肌梗死心血瘀阻证代谢途径与缺氧后的糖代谢紊乱密切相关。这些发生变化的代谢物可以作为心血瘀阻证的潜在生物标志物进行深入研究。3.2中医证候研究王勇等采用NMR及NOESY(Nuclearoverhausereffectspectroscopy)序列核磁共振技术和模式识别技术研究冠心病心肌缺血血瘀证小型猪血清代谢物谱显示,相对于假手术组,模型组血清中葡萄糖糖升高、低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白降低,血液黏滞度升高,与中医对血瘀证“浓、黏、凝、滞”的描述相符。可见,通过对证候相关代谢谱的研究,能够对中医证型进行相关规范化研究。模型血清中内源性代谢物柠檬酸、γ-氨基丁酸、乳酸等特定分子含量上升,提示其可能成为冠心病临床诊断与治疗的靶标,并为证候客观化研究提供新的方法与思路。王勇还利用CPMG(Carr-Purcell-Meiboom-Gill)序列核磁共振技术研究去乳酸后慢性心肌缺血血瘀证小型猪血清差异代谢物的改变情况发现模型组血清中内源性代谢物苹果酸、谷氨酸、肌醇等含量上升,N-氧三甲胺等代谢物浓度下降。这些代谢物的特征组合模式可能成为慢性心肌缺血血瘀证临床诊疗的参考指标,并为研究证候的客观化提供新的思路。3.3pca检测l-血酸、d-葡萄糖酸、丙氨酸、戊二酸含量潘秋等采用高脂饮食联合链脲佐菌素制备糖尿病脾气亏虚、痰瘀互阻证大鼠模型,并用GCMS和PCA技术分析第3、6周尿液发现,第6周L-抗坏血酸、D-葡萄糖酸、丙氨酸、十八烷酸、戊二酸含量较正常对照组和第3周增加。这些差异小分子物质构成了糖尿病“脾气亏虚、痰瘀互阻证”的代谢标志物群,成为了脾气亏虚、痰瘀互阻证代谢水平上的物质基础。3.4-酮戊二酸及其他-内酰胺-乙酸氧基的含量王伟明等利用NMR和PCA技术研究肝气郁结证大鼠发现,与正常组比较,模型组大鼠尿液马尿酸、α-酮戊二酸、柠檬酸、异柠檬酸和鸟头酸的含量降低,肌酸酐、丙酮、乙酸、肌酸、烟酸和5-羟(基)吲哚-3-乙酸谱峰相对积分面积明显增高,在尿液中的含量显著升高。结果说明尿液代谢组学的变化可以反映大鼠的生理病理基础,提示肝气郁结证与三羧酸循环能量代谢糖酵解途径受到影响密切相关。3.5生化产物的筛选邹忠杰等运用代谢组学方法研究利血平所致脾虚大鼠血清和尿液代谢表型的变化,最终在血清中发现3-羟基丁酸、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白/甲硫氨酸等12种标志物,在尿液中发现柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸等10种生物标志物。这表明脾虚状态下机体存在糖能量及氨基酸代谢紊乱。4研究数据的可重复性目前代谢组学在中医疾病证候研究领域尚处于初级阶段,虽然取得了一定的成果,但仍存在许多不足。如目前临床研究样本量较少,证候诊断标准不统一,使得难以取得可重复性的实验数据。构建的动物模型难以得到行业的公认,传统中医的四诊资料难以采集,相关代谢指标和中医证候间的对应关系也存在疑问。又如采用代谢组学的实验数据如何合理进行分析。因此,在今后的研究中,从临床和实验两方面同时开展证候研究,进一步增加临床样本量,严格把握证候诊疗标准,以保证研究结果的可重复性。并将代谢组学、蛋白质组学等系统生物学方法、技术进行有效整合,才能真正实现对中医证候整体、动态、全面的把握,走出一条中医证候研究的特色之路。2.1.1血浆代谢产物谱张红栓等对10例痰浊证患者和10例血瘀证患者的血浆样本进行了1H-NMR(1H-NuclearMagneticResonance,氢核磁共振谱)检测,并用主成分分析PLS-DA(Partialleastsquaresdiscriminantanalysis,偏最小二乘判别分析)研究2组血浆代谢物图谱的差异。1H-NMR图谱模式分析显示,2组血浆样本代谢物差异显著:痰浊证组低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、脂类物质、葡萄糖、半乳糖、N-乙酰糖蛋白含量均高于血瘀证组。研究表明痰浊证的脂代谢和糖代谢均较血瘀证紊乱,提示血浆代谢物变化在一定程度上能区分冠心病心绞痛的不同证型。张红栓还研究了血瘀证与痰浊证患者的尿液代谢产物谱发现:血瘀证组尿液中柠檬酸、α-酮戊二酸、顺式-乌头酸、葡萄糖、3-羟基丁酸、丙酮、酪氨酸、肌酐、氧化三甲胺、二甲胺、马尿酸含量低于痰浊证组,胆汁酸、组氨酸高于痰浊证组。研究显示尿液代谢物中小分子的变化一定程度上可以作为不同证型的物质基础。2.1.2高血压病的组织病理学杨传华等采用LC-MS(液相色谱-质谱联用仪)技术对12例高血压病肝阳上亢证和14例阴阳两虚证患者血浆进行了研究,结果显示肝阳上亢证组雌二醇、白三烯、葡萄糖神经酰胺、神经酰胺相对增多,而阴阳两虚证组中甘油三酯和甘油二酯相对增多。该结果提示以上六种可以成为两种高血压证候的临床诊断鉴别点。蒋海强等对10例高血压病肝阳上亢证患者及12名健康志愿者的尿液进行了代谢组学分析,发现N-乙酰神经氨酸、去甲肾上腺素、泛酰巯基己胺等15个潜在代谢标志物,揭示了肝阳上亢证可能与磷脂代谢、脂肪酸代谢和花生四烯酸代谢异常相关。蒋海强等还采用GC-MS(Gaschromatograph-massspectrometer,气相色谱-质谱联用仪)技术分析9例高血压病肝阳上亢证患者及11例健康志愿者尿液发现硬脂酸、肌醇、D-果糖和邻苯二甲酸等潜在生物标志物,揭示了肝阳上亢证可能与氨基酸代谢、磷酸肌醇代谢、脂肪酸代谢及糖代谢异常相关。范群丽等对高血压病肝火亢盛型24例、痰湿壅盛型15例、阴虚阳亢型17例患者及21例标准健康人血清进行了气相色谱-飞行时间质谱技术分析,发现相对于健康人,尿酸、尿素和肌酐醇较高,氨基酸、小分子有机酸、脂肪酸类、脂类及糖醇类较低。该研究提示健康人与高血压病人及高血压病不同证型之间存在物质基础差异。2.1.3血清氨基酸及-葡萄糖的变化尤丽等对33例肾虚痰瘀型2型糖尿病患者和50例健康人血清进行核磁共振氢谱分析,结果显示肾虚痰瘀型2型糖尿病患者与健康人相比血清中多种氨基酸显著降低,乳酸、柠檬酸、肌酸及肌酸酐也较健康人显著降低。同时,α-葡萄糖及β-葡萄糖较健康人增加。研究结果提示,肾虚痰瘀型2型糖尿病患者代谢成分与健康人存在显著差异,其作用机制可能是肾虚痰瘀型2型糖尿病患者体内的三羧酸循环及糖酵解途径被抑制,蛋白质代谢异常,支链氨基酸代谢增强,这些将有助于阐明糖尿病证候的形成。2.1.4中医证候学意义张一博等采用GC-MS技术对31例慢性乙肝肝气郁结证患者、对照组16例肝血瘀证患者及30例健康人的血清进行研究发现,与健康人相比,肝气郁结证患者有差异明显的代谢物质,但与对照组肝血瘀证患者代谢物质的差异性PCA(Principalcomponentanalysis,主成分分析)分析提示,得分图上有一定分离趋势,但并不能完全分开。研究结果说明中医证候是有其生物学物质基础的。郭孜等采用GC-MS技术的尿液衍生化方法,分析乙肝后肝硬化患者湿热内蕴证、肝肾阴虚证等不同证候内源性小分子代谢物发现,与正常人比较,乙肝后肝硬化患者存在大量的与能量代谢和氨基酸代谢通路有关的差异性尿代谢物,主要包括丙二酸、苯酚、缬氨酸等。同时,还发现与健康人相比,湿热内蕴证患者亮氨酸和缬氨酸成升高趋势,而肝肾阴虚证无显著性差异。研究表明,乙肝肝硬化不同证候具有不同的代谢模式,而这些潜在标志物群可以作为临床区分不同证型的生物学标志。王喜军等采用超高效液相色谱-时间飞行质谱结合PCA等分析技术对黄疸型肝炎及阴黄证和阳黄证两个亚型患者的尿液进行研究显示,相对于正常人,黄疸综合征组有肾上腺素等44个差异性代谢物,阳黄证有激动素等40个差异性代谢物、阴黄证有α-N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺等差异性49个代谢物。进一步分析发现,阳黄证的形成可能与维生素B6、精氨酸、脯氨酸及色氨酸的代谢异常有关,阴黄证的机制可能涉及类固醇激素的生物合成、初级胆汁酸合成及半胱氨酸蛋氨酸代谢紊乱有关。该研究为阳黄证和阴黄证的证候客观化提供新的思路。2.1.5艾患者与健康对照组患者的山液代谢产物代谢谱比较谢世平等采用液质联用技术结合PCA方法分析、比较12例艾滋病病毒携带者、艾滋病患者脾肺气虚证者和8例健康对照者的尿液代谢产物代谢谱的差异,结果表明代谢组学研究方法可以将艾滋病病毒携带者、艾滋病患者脾肺气虚证者脾肺气虚证者的尿液代谢轮廓与健康对照组进行良好的区分,为诊断提供一定的客观依据。2.2.1代谢产物谱检测崔海珍等采用1H-NMR结合PLS分析研究亚健康肝郁证