led灯下gnrh神经元和神经纤维的分布

led灯下gnrh神经元和神经纤维的分布

促性腺激素释放激素（gnrh）也被称为急促性激素释放激素（lhrh），是大脑-76个腺体轴和生长轴的主要信号。如果体内缺乏这种物质,促性腺激素不能从垂体前叶释放,生殖器官将处于未发育状态或退化,这表明GnRH在脊椎动物生长发育和生殖功能上起着重要的调控作用,其合成和分泌受机体内、外因素的制约。禽类具有优越的视觉机能,特别是具有发达的色觉,其生产性能和性腺发育对光色反应不同。有报道显示,当用不同的光色照射禽类下丘脑时,蓝、绿光组外周血中LH浓度显著高于红、黄和紫外光组。此结果提示:下丘脑GnRH的表达与光色有关。Benoit等用红光照射野鸭下丘脑,发现性腺发育明显加快,表明光色对禽类生产性能的影响可能受下丘脑GnRH的分泌调控。发育生物学研究显示,禽类下丘脑GnRH神经元的分布在胚胎期已发育成熟,并且已具有分泌功能。然而,到目前为止,在其性成熟启动过程中,光色对成年禽脑GnRH分布以及表达的影响还未见报道。因此,本试验采用免疫组化的方法研究单色光对雄性AA肉鸡脑内GnRH神经元分布及表达的影响,为进一步阐明单色光对肉鸡生产性状表达影响的作用机理提供理论依据。1材料和方法1.1鸡头品质指标nm0日龄雄性AA肉鸡24只,分为4个处理组,每组6只,分别在白(400～760nm)、红(660nm)、绿(540nm)和蓝(480nm)LED灯(发光二极管,中山市晶明光电科技有限公司制造)下饲养7周。光照度为鸡头水平方向15lx,使用ST-85自动照度仪(北京师范大学光电仪器厂)测量。光照制度23h∶1h(L∶D)。自由采食和饮水,饲养过程严格遵循《AA肉鸡饲养管理手册》。1.2开颅大异醛磷酸缓冲液组49日龄AA肉鸡腹腔注射戊巴比妥钠(45μg·g-1),深度麻醉保定后,打开胸腔,心脏灌流固定,依次注入0.75%生理盐水500mL、4%多聚甲醛磷酸缓冲液(0.1mol·L-1,pH7.4)2000mL,开颅取脑置于4%多聚甲醛磷酸缓冲液(0.1mol·L-1,pH7.4)后固定48h。按常规方法脱水、透明、石蜡包埋,制作片厚10μm的连续切片。1.3d生物素质试验切片常规脱蜡至水,0.01mol·L-1PBS(pH7.4)水洗3次,微波修复抗原20min,冷却至室温,3%的H2O2室温孵育30min,PBS洗3次,10%正常山羊血清室温封闭30min,加入兔抗GnRH多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司,BA0900,1∶200),4℃过夜。室温平衡30min,PBS洗3次,滴加生物素化山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司,SP-9001)室温孵育2h。PBS洗3次,加入辣根酶标记的HRP复合体(北京中杉金桥生物技术有限公司,SP-9001)室温孵育1.5h,PBS洗3次。DAB显色,苏木精复染,脱水,透明,封固。1.4免疫组化染色根据鸡脑立体定位图谱,并结合光镜观察结果确定GnRH神经元的分布位置。免疫组化染色的每组切片中,相同核团部位用Olmpus显微镜(BX51,Olympus)进行数码拍照,由ScionImage软件(VersionBeta4.0.2,美国Scion公司)测量阳性胞体的大小,用“+”表示GnRH免疫组化染色后阳性细胞的表达强弱。2结果2.1gnrh兴奋摧毁间脑和中脑的分布2.1.1gnrh免疫反应阳性神经元和神经纤维的分布免疫组化染色结果显示,视前室周核(Nucleuspreopticusperiventricularis,POP)、视前内侧核(Nucleuspreopticusmedialis,POM)、下丘脑室周核(Nucleusperiventricularishypothalami,PHN)、室旁大细胞核(Nucleusparaventricularismagnocellularis,PVN)、皮层联合核(Nucleuscommissuraepallii,nCPa)和正中隆起(Medianeminence,ME)有GnRH免疫反应阳性神经元和神经纤维分布。神经元大小不一、形态各异,胞体呈圆形、多角形或不规则形,胞核位于细胞中央,胞体直径为15～60μm,密集或散在分布,多为单极或双极神经元,胞体和突起内含有棕黄色GnRH反应物质。2.1.2gnrh阳性神经元和神经纤维分布丘脑腹外侧核(Nucleusventrolateralisthalami,VLT)、丘脑前外侧核(Nucleuslateralisanteriorthalami,LA)、上网状核背侧部(Nucleusreticularissuperior,parsdorsalis,RSd)、前脑外侧束(Fasciculusprosencephalilateralis,FPL)、枕中脑束(Tractusoccipitomesencephalicus,OM)、卵圆核(Nucleusovoidalis,OV)、圆核(Nucleusrotundus,ROT)、顶盖丘脑束(Tractustectothalamicus,TT)、丘脑后背内侧核(Nucleusdorsomedialisposteriorthalami,DMP)、缰内侧核(Nucleushabenularismedialis,HM)和缰下内侧核(Nucleussubhabenularismedialis,SHM)有GnRH阳性神经元和神经纤维分布。神经元胞体呈圆形、卵圆形、梭形或三角形,细胞直径为10～40μm。2.1.3traftalis,gsc或顶盖联合trth阳性神经元/神经纤维分布中脑的中央灰质层(Stratumgriseumcentrale,SGC)和顶盖联合(Commissuratectalis,CT)有GnRH阳性神经元和神经纤维分布,胞体呈圆形、椭圆形或不规则形,细胞直径为15～50μm。2.2单色光对鸡间大脑gnrh的影响2.2.1gnrh神经元表达强度单色光对鸡下丘脑GnRH神经元表达强度的影响见表1。由表1可看出,蓝光组在视前室周核、视前内侧核、下丘脑室周核和室旁大细胞核的GnRH神经元表达强度显著高于红光组,且在视前室周核、下丘脑室周核和室旁大细胞核(图1)呈强阳性表达(++++)。白、绿光组在视前室周核和视前内侧核表达强度较小(++),而在下丘脑室周核和室旁大细胞核白光组表达强度显著高于红、绿光组。2.2.2神经元表达情况图2为不同光组GnRH神经元在圆核的表达图片。从图中可看出,各光组GnRH神经元表达强弱先后顺序为:蓝光组>白光组>绿光组>红光组。单色光对丘脑圆核和卵圆核GnRH神经元表达强度的影响见表2。光镜观察结果显示,蓝光组圆核和卵圆核GnRH神经元呈强性表达(++++),其表达强度显著高于红、绿光组。3不同光照对照照系gnrh表达的影响下丘脑-垂体-性腺轴是性腺发育成熟和生殖功能正常进行的基础。下丘脑分泌的GnRH、垂体分泌的促性腺激素(FSH、LH)和性腺分泌的性激素(雌激素、雄激素)之间存在着正、负反馈调节机制,因此研究GnRH在脑内的分布及表达为探讨单色光对禽类生产性能影响的作用机制提供依据。目前,利用免疫组化方法显示禽类GnRH神经元的分布已有很多报道,如GnRH阳性神经元分布在隔区、视前区、下丘脑前外侧部、嗅球、结节、端脑、丘脑和中脑,然而对性成熟前鸡脑内GnRH的分布还未有报道。本研究结果显示,7周龄鸡脑GnRH神经元在间脑和中脑广泛分布,其分布方式与3周龄罗曼鸡脑内GnRH神经元在间脑和中脑的分布方式相同。有关哺乳动物的研究显示,夜间GnRH低频、低幅的脉冲式释放是性成熟启动必需条件。然而,下丘脑GnRH基因表达的发育性变化却存在种间差异。如:啮齿类动物下丘脑GnRHmRNA水平呈年龄相关性逐渐增加趋势,且在接近性成熟时显著增加。然而,在性成熟启动前,灵长类动物下丘脑GnRH神经元数目及mRNA表达丰度无明显变化。上述种间差异是由性成熟启动的神经内分泌机制不同造成。与哺乳动物一样,禽类生殖活动也主要受生殖轴下丘脑-垂体-睾丸轴的调节。发育生物学研究显示,禽类下丘脑GnRH神经元的分布在胚胎期已发育成熟,并且已具有分泌功能。而在其性成熟启动过程中,不同光色对下丘脑GnRH表达的变化尚未见报道。Follett等认为下丘脑存在光受体,这些光受体能够将光信号转化为神经冲动,通过内分泌系统的逐级放大调节卵巢、睾丸的发育、功能及各种与繁殖有关的机能,如繁殖行为、第二性征等。如雄性成年家雀由16L∶8D的光照环境转移到13L∶11D后,下丘脑视前区和正中隆起的GnRH神经元与神经纤维增多,睾丸重量提高,这说明禽类下丘脑GnRH的表达受光照环境的影响。Rani等的研究表明,禽类对短波长的光敏感,即短波长的光可将光不应阶段的禽类恢复为光敏感状态,而对长波长的光则会产生并有效的维持光不应性,并使脑内GnRH表达以及外周血中LH和FSH的含量显著下降。本研究结果显示,蓝光组GnRH神经元在下丘脑视前室周核、视前内侧核、下丘脑室周核和室旁大细胞核以及丘脑的圆核、卵圆核呈强阳性表达,其表达强度显著高于红、绿光