芍药苷对体外白色念珠菌生物膜的抑制作用

芍药苷对体外白色念珠菌生物膜的抑制作用

不同质量浓度两社会糖苷对白色真菌细胞黏附的抑制作用本实验的创新观察表明，芍药对于白净菌的生物膜的抑制作用，不同质量浓度的芍药对白色细菌的细胞粘附具有抑制作用，白色细菌的生物膜也有抑制作用，抑制率与药物的质量浓度呈正相关。0细菌耐药性增加白色念珠菌是口腔的正常菌群之一,在正常情况下其与口腔中的其他正常微生物一起维持口腔中的生态平衡,当大量应用抗生素控制细菌繁殖时,对抗生素不敏感的白色念珠菌乘机大量生长,破坏口腔微生态系平衡,进而出现菌群失调,导致口腔白色念珠菌生物膜相关感染频繁出现,患者真菌感染发病率明显增高,各大医药厂商不断推出新的抗真菌药物,这样一来产生的不利影响是耐药性菌株不断地被筛选,耐药性菌株大量增加。由于唑类抗真菌药如氟康唑与伊曲康唑等临床效果较好,成为医生的首选药物,而广泛应用是耐药性菌株大量增加另一个重要原因。附着在根管内壁的生物膜被称之为根管生物膜,是根尖周炎的主要致病因素。有文献报道称白色念珠菌作为感染根管内真菌的主要组成部分,被认为是导致根管治疗失败的原因之一,以生物膜形式存在的微生物可降低抗菌药物的敏感性,甚至产生耐药性,这也是临床上与生物膜形成相关感染性疾病难以治疗的原因之一。近年来,随着广谱抗生素及免疫制剂广泛应用,耐药菌株逐年上升,真菌感染呈明显上升趋势,并伴随并发症的发生。传统中药具有作用持久,毒性小等特点,所以从天然药物中即中药中开发利用新的根管抗菌药物具有非常广阔的前景,因此从中药中寻找抗白色念珠菌生物膜的新药无疑是一个新的选择。以往研究报道中药赤芍有效成分对白色念珠菌有较好的抑制作用,但其单体芍药苷白色念珠菌生物膜是否有抑制作用未见报道。实验观察芍药苷对白色念珠菌生物膜的抑菌作用,探讨其在口腔生态失调中的意义,为芍药苷治疗白色念珠菌引起的难治性根管感染和根尖周炎提供新途径。1菌株制备和培养对比观察实验。白色念珠菌ATCC90028,购自中国医学科学院微生物研究所;芍药苷(国药试剂产品编号SM212806);醋酸洗必泰(锦州九泰制药有限公司)。MTTDMSOPIFDA(Sigma公司);YPD液体培养基(蛋白胨20g/L),(酵母提取物10g/L),(葡萄糖20g/L)、沙堡琼脂培养基(蛋白胨10g/L),(葡萄糖40g/L)、(琼脂20g/L)、RPMI-1640(GIBICO公司);胎牛血清(杭州四季青公司)。MultiskanMK3全自动多功能酶标仪(ThermoScientific,美国);激光共聚焦显微镜(U-TB190型日本Olympus公司)。①MTT溶液制备:用0.22μm的滤器以pH7.2的PBS配制5g/L的MTT,过滤除菌分装后避光保存于4℃冰箱中。②白色念珠菌菌液的制备:将冻存的标准白色念珠菌菌株进行复苏,并立刻接种到沙堡琼脂培养基上,37℃恒温培养箱中培养48h。在无菌超净工作台上将单菌落接种在YPD液体培养基中,37℃恒温培养箱过夜培养12h,将冻存的菌株解冻接种于沙氏培养,收集菌体后以pH7.2的PBS冲洗3遍,血细胞计数板计数后,以RPMI-1640培养液稀释,将菌悬液浓度调整为1×109L-1。标准菌悬液制备好之后立即应用到实验中。体外抑菌活性测定实验共分4组,实验组、洗必泰组、阴性对照组与空白对照组。实验组芍药苷经DMSO(<3%)助溶后,用RPMI-1640分别按2倍稀释法制备5个浓度梯度:4,2,1,0.5,0.25g/L,观察芍药苷对白色念珠菌的抑制。洗必泰组将母液用RPMI-1640稀释成5个浓度梯度:2%,1%,0.5%,0.25%,0.125%,观察洗必泰对白色念珠菌的抑制。阴性对照组观察RPMI-1640对白色念珠菌的抑制。空白对照组仅加入RPMI-1640培养液,无白色念珠菌。①加菌液:利用微量加样器将1×109L-1的标准菌液100μL分别加入沙堡琼脂培养基中。②菌液定植:用20cm的无菌玻璃棒涂匀,37℃恒温培养箱培养1h。③打孔封底:以1mL规格的TIP头在沙堡琼脂培养基上打5孔,利用琼脂封底,室温等待琼脂凝固。④加药培养:用微量加样器取出不同梯度浓度药液各100μL分别加入各小孔中,放入37℃恒温培养箱中培养24h。⑤测量:不同浓度药物对白色念珠菌产生的抑菌环直径利用游标卡尺在深色背景下测量,为取平均值每孔测量3次。⑥结果计算:平行实验10组,取平均值,结果以x_±s表示。将100μL浓度为1×109L-1的菌液加入96孔板,第1-10孔加入按2倍稀释浓度梯度的芍药苷各100μL,第11,12孔给予RPMI-1640培养液100μL,设第11孔为阴性对照孔,12孔为空白对照孔,37℃分别培养60,90,120min,弃去培养基及浮菌,用PBS冲洗3次,将20μL5g/LMTT加入各孔,37℃避光孵育4h,弃去含MTT的培养基,PBS洗涤3次,加入150μLDMSO振荡15min,使结晶充分溶解,全自动酶标仪A490nm波长检测吸度光值。每组设8个复孔,重复3次。将100μL浓度为1×109L-1的菌液接种于96孔细胞培养板中,37℃分别培养48h,弃去培养基及浮菌,用PBS冲洗3次,实验组每孔加入100μL梯度芍药苷溶液,设阴性对照孔、空白对照孔,MTT法测量各孔在490nm波长处的A值。每组设8个复孔,重复3次取平均值。抑菌率=(阴性对照孔A值-实验组A值)/(阴性对照孔A值-空白对照孔A值)×100%。将100μL浓度为1×109L-1的菌液接种于24孔细胞培养板中,培养基1500μL,37℃培养48h形成生物膜,去除孔内培养基,PBS冲洗浮游菌,加入500μL芍药苷溶液或洗必泰,37℃培养48h,弃去残液,PBS冲洗3次去除浮游菌,在暗箱中FDA-PI染料(体积配比为1∶1)染色孵育25min,于激光共聚焦显微镜下观察,观察条件为Ai激光(514nm/488nm),HeNe激光(543nm)。在激光共聚焦显微镜下死菌被碘化丙啶(PI)染色呈红色,活菌被FDA染色呈绿色。实验分阴性对照组、洗必泰组、实验组,每组4个平行样,3次实验。不同质量浓度洗必泰或芍药苷对白色念珠菌细胞黏附的作用,以及对白色念珠菌生物膜的抑制作用。全部数据采用SPSS17.0统计软件处理。实验重复3次,计量资料用ue0af±s表示,各组及组间比较用方差分析检验,若数据不满足方差齐性则采用Tamhancet′检验。2结果的结果2.1两组抑菌直径比较阴性对照组平皿表面长满菌落。实验组与洗必泰组均有抑菌环产生,抑菌环直径与药物浓度呈正相关。4,2,1,0.5,0.25g/L芍药苷组抑菌直径分别为(33.420±1.027),(29.610±2.048),(21.790±1.546),(17.350±1.756),(12.670±2.364)mm。2%,1%,0.5%,0.25%,0.125%洗必泰组抑菌直径分别为(28.440±2.421),(27.140±2.105),(24.830±1.824),(21.460±1.554),(18.750±1.223)mm。经方差分析,组内两两比较差异有显著性意义(P<0.05);组间两两比较,仅2g/L芍药苷与2%,1%洗必泰抑菌环直径相比差异无显著性意义(P>0.05)。2.2mtt法测定了芍药核苷酸对白色念菌细胞的粘附作用与阴性对照组相比,不同质量浓度芍药苷对60,90,120min的白色念珠菌细胞黏附均有抑制作用(表1)。2.3g/l麻黄苷对白色真菌生物膜的抑制率抑制率结果(表2)与质量浓度呈正相关,4g/L芍药苷对白色念珠菌生物膜的抑制率可达92.63%。组内两两之间比较差异均有显著性意义。2.4关于生物膜的抑菌活性白色念珠菌在RPMI-1640培养基中培养48h形成的生物膜是以菌丝相为主形成的致密的网状系统,菌丝体间有间隙。正常生理代谢条件下,生物膜中死菌数量极少,细胞生长旺盛。在不同浓度芍药苷干预下,有假菌丝形成,生物膜形成受限,生物膜中死菌含量明显升高,其抑菌活性较洗必泰弱,见图1。洗必泰组经过48h作用后绿色活菌未出现,见图2。3mtt法测真核细胞活性的变化目前白念珠菌是最常见的导致念珠菌病的致病菌,约76%的临床病例都与其有关,白念珠菌属真菌界一半知菌亚门一芽抱菌纲一隐球酵母目一隐球酵母科一隐球酵母属,白念珠菌能形成生物膜,生物膜由不同形态的菌体共同构成,包括酵母相、假菌丝相和菌丝相细胞。三唑类康氟唑抗真菌药物是临床上治疗念珠菌感染的经常用到的主要药物之一,由于抗生素的大量生使用,结果导致越来越多白色念珠菌耐药菌株的出现,对这样耐药性菌株的抑制手段有限,由于唑类药物经大部分代谢通过肝脏进行,并且对肝脏有显而易见的损伤作用,所以局限了唑类药物在临床中的使用范围。目前临床应用的抗真菌药物在高效低毒、抗菌谱和耐药性方面不能令人满意,因此,从中草药中寻找抗真菌新药用于临床或与唑类药物联合应用,弥补唑类药物治疗中的不足,已成为非常重要的研究方向。实验所采用的芍药苷属于单萜糖苷类化合物,是中国传统中药赤芍的两个主要化学成分之一,赤芍对白色念珠菌表现出强抑制活性。实验使用的MTT是四氮唑盐减低法测定真核细胞活性的重要工具;是一种黄颜色商品名为噻唑蓝化学名为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐的染料,MTT在活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶作用下代谢还原,不溶于水的蓝色(或蓝紫色)甲臜在细胞色素C的作用下生成并沉积在细胞中,二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,在通常情况下,活细胞数与甲臜产生量呈正相关,酶标仪在490nm处可以测定甲臜的含量。因此活细胞的数目可根据吸光值推测出。MTT法以其快速简便,不需要特殊检测仪器,无放射性同位素,适合大批量检测的特点而得到广泛应用。实验根据Ramage等方法,在96孔培养板上形成根管内白色珠菌生物膜的体外模型,采用MTT法测定芍药苷对白色念珠菌黏附在根管内形成白色念珠菌生物膜的作用。实验为观察不同浓度梯度芍药苷对白色念珠菌的药物敏感性,选用的是琼脂扩散法,即比较药物作用后含药孔抑菌直径大小和比较药物孔抑菌直径之间的大小,来观测药物的敏感性。结果显示在抑菌直径方面,2g/L芍药苷与2%洗必泰的抑菌结果差异无显著性意义,证明在抑制白色念珠菌作用方面,2g/L芍药苷与2%洗必泰作用相似。MTT法测定芍药苷对白色念珠菌黏附作用影响,以及芍药苷对48h白色念珠菌生物膜吸光值值大小的结果,说明芍药苷对白色念珠菌生物膜具有较强抑制作用。对比与阴性对照组,随着芍药苷浓度的增加及时间的延长,白色念珠菌的黏附性降低,表明芍药苷对白色念珠菌在60,90,120min的细胞黏附具有抑制作用。另外FDA/PI荧光染色方法及CLSM观察不同浓度芍药苷对培养48h白色念珠菌生物膜作用的观察显示,常态生物膜中由大部分活菌和有少量死菌组成,药物浓度与白色念珠菌生物膜中的死菌比例呈正相关;与洗必泰相比,芍药苷的抑菌能力相对较弱。生物膜的感染越来越成为临床上难以克服的问题之一,实验结果说明应用芍药苷治疗根管内感染具有一定的潜力,尤其是由白色念珠菌生物膜引起的难治性或治疗失败的根管感染,可为临床开发抑制白色念珠菌生物膜的中药制剂提供一定的参考。实验只探究了中药赤芍中主要单体对白色念珠菌生物膜的抑菌作用,未来的研究还需进一步指向中药赤芍中其他单体是否对白色念珠菌生物膜有抑制作用,并探究其药理作用及抑菌机制。生物膜-是科技进步给消毒灭菌行业带来的最新一系列挑战之一,紧密黏附于医疗器械表面且难以去除的,细菌团块与细胞外基质的复合体。通俗地说,生物膜是由细菌在其分泌的黏液(黏多糖)内形成的结构,包裹着细菌的生物膜为细菌提供了保护,使得后者很难被清除。文章为原创作品,无抄袭剽窃,无泄密及署名和专利争议,内容及数据真实,文责自负。设计材料试剂仪器试剂制备实验组以抗菌环检测芍药酚沙贝林培养基平剂的抗菌能力本法对抗白色细菌固定效果的测定不同浓度的芍药酚类抗生物膜对48h白色羊皮纸c的影响计算抗菌率的公式如下所示用f-pi的荧光染色方法和激光联合扫描显微镜观察了不同质量浓度的芍药酚对48h白色生物膜的影响主要观察指标动态观察与微观观察相结合目前对生物膜进行形态学研究的方法主要是使用荧光显微镜、扫描电镜、激光共聚焦显微镜观察;扫描电镜的优点是能直接观测生物膜中细胞的情况,但是需要对标本进行脱水、固定、包埋、染色等处理,这样就破