大鼠下丘脑室旁核微量注射a1a2受体阻滞剂对肾侧感系统的影响

大鼠下丘脑室旁核微量注射a1a2受体阻滞剂对肾侧感系统的影响

据统计，心跳次数（hf）的年死亡率为10%，是65岁以上老年人住院的主要原因。心衰的确切病因至今仍不十分明确,大量研究结果显示心衰时循环内分泌激活,主要是肾素-血管紧张素(angiotensin,Ang)-醛固酮系统的激活可加速心力衰竭的恶化。交感神经兴奋增强是慢性心衰的重要病理特征,其可导致外周血管阻力的增加,增加心脏的后负荷,肾上腺皮质醛固酮释放增加,水钠潴留,从而增加心脏的前负荷。因此,降低心衰状态下交感神经的活性可以明显降低心衰的死亡率。据相关文献报道,阻断脑内血管紧张素系统的活性能导致慢性心衰交感神经兴奋性显著降低。下丘脑室旁核是心血管系统功能调节的重要区域,其调节了交感神经活动的输出,它与大脑其它神经核团存在密切联系,包括延髓头端腹外侧区(rostralventrolateralmedulla,RVLM)、孤束核(nucleustractussolitarius,NTS)、脑桥的蓝斑核(locuscoeruleus,LC)等,这些区域对心血管系统起着重要的调节作用。本研究制作大鼠心梗后心衰模型,后腹膜途径寻找肾交感神经,利用AngⅡ-1型(angiotensinⅡtype1,AT1)和2型(angiotensiⅡtype2,AT2)受体阻滞剂微量注射于下丘脑室旁核,记录心率、血压和肾交感神经的活性,探讨慢性心衰的中枢调控机制。材料和方法1sd大鼠单次给药后hfat1和shamveh检测选用SD大鼠,雄性,体重180-220g,由南通大学实验动物中心提供。实验室分笼饲养,予以标准鼠粮和自来水,保持笼内通风干燥,室温18-22℃。SD大鼠随机分为2大组:手术组(HFAT1组、HFAT2组、HFVeh组)和假手术组(shamAT1组,shamAT2组、shamVeh组)。4周后采用Stoelting大鼠脑立体定位仪进行定位,POWERLAB8/30系统采集信号(Adinstrument)系统记录心率、血压和肾交感神经放电信号。2溶液的配制AT1受体阻滞剂(L-158809)和AT2受体阻滞剂(PD123319)均购自Sigma,用生理盐水溶解、配制为0.1mol/L的溶液。人工脑脊液(artificialcerebrospinalfluid,ACSF)[pH7.4,含有(mmol/L):NaCl130,KCl2.99,CaCl20.98,MgCl2·6H2O0.80,NaHCO325,Na2HPO4·12H2O0.039,Na2HPO4·2H2O0.46],-20℃冻存备用。3腰椎开枝形传统冠脉结扎诱导慢性心衰动物模型:SD大鼠在水合氯醛麻醉下仰位固定于手术台,自左侧3-4肋间开胸,暴露心脏,于肺动脉圆锥及左心房之间找出冠脉左前降支,以0号线立即结扎冠脉,迅速关闭胸腔,并用负压吸引吸出胸腔内血液和气体。假手术组仅置缝线而不结扎冠脉。术后肌注青霉素。术后第4周末对假手术组大鼠与心衰组大鼠进行实验。4肝素钠盐水凝胶的检测使用乌拉坦麻醉各手术大鼠,行颈部切口并分离右颈总动脉,结扎远心端,用动脉夹夹住近心端,在管壁上剪一很小的斜口,插入内径0.5mm、外径1mm并充满1×105U/L肝素钠生理盐水的聚乙烯导管,经右侧颈总动脉向心端缓慢插入左心室,导管另一端通过压力换能器连接到生理记录仪,同步采集心率(heartrate,HR)、左心室收缩压(leftventricularsystolicpressuer,LVSP)、左心室舒张末期压(leftventricularend-diastolicpressure,LVEDP)和左心室内压最大上升或下降速率(±dp/dtmax)。LVEDP≥15mmHg为心衰模型成功的标志。5神经组织学检测血流动力学检测后对符合实验标准的各手术大鼠行颈部切口并分离气管,行气管切开,股静脉置管,术中使用肌松剂驰肌碘(gallamin)以25mg·kg-1·h-1持续泵入。行颈部切口并分离右颈总动脉,导管接压力换能器,与桥式放大器相连,POWERLAB8/30同步采集测动脉血压、平均动脉压和心率(HR);后将动物俯位固定于大鼠脑立体定位仪上,再将大鼠取侧俯卧位,经腹膜后暴露左肾,在手术显微镜下剥离肾交感神经,将神经置于双极铂丝电极上,灌入配制好的温热液体石蜡(37℃),使神经与记录电极结合处于周围组织绝缘并湿润和保护神经。POWERLAB8/30系统采集信号,记录肾交感神经活动(renalsympatheticnerveactivity,RSNA)。6后槲至同一水平大鼠固定在脑立体定位仪上,沿矢状缝做皮肤切口暴露颅骨,调整前囟和后囟至同一水平。PVN定位:B=1.8mm,L=0.4mm,H=7.9mm。B表示为前囟向后,L表示正中线左右旁开,H表示硬脑膜下深度。电钻颅骨钻孔,再用微量注射器插入PVN内。7肾两种放电的噪声实验结束时,10%KCl静脉注入处死动物,以此时神经放电积分值作为肾交感神经放电活动的噪声水平。室旁核内微量注射2%滂胺天蓝溶液(50nL)。剪取头颅,去除颅骨,将脑组织固定于10%甲醛溶液中,2d后作切片,在显微镜下定位微量注射点位置,定位不准确者不列入统计。8rsnd反应数据用均数±标准差(ˉx±s)(x¯±s)表示,两组间数据分析使用t检验,多组间数据比较使用q检验。统计学分析中,肾交感神经放电(renalsympatheticnervedischarge,RSND)对药物的反应以注药前后实测值之差与注药前相比的百分率表示,其中,微量注射前取1min内RSND的平均值,微量注射后,在达到最大反应后的1min时间内求RSNA反应的平均值。RSND值以实测值与噪声值之差表示,噪声值为股静脉注射10%KCl后10min的RSNA值。所有实验数据通过SPSS软件17.0进行分析。结果1大鼠肝功能的评估1.1流量动力学的测量术后4周检测大鼠血流动力学,手术组大鼠LVEDP较假手术组明显增高(P<0.05),LVSP高于假手术组,但无显著差异,见表1。1.2各组大鼠肺/体重值的比较取实验后大鼠心脏,实验结束后立即剪开胸壁暴露心脏与肺脏,随即剪取心脏与肺脏,将心脏在滤纸上沥干,称重。同时称取肺湿重。将心脏重与总体重相除,得到心脏/体重值,将肺湿重与总体重相除,得到肺/体重值。假手术组及心衰组大鼠的指标均来自于手术后4周获得的组织标本。心衰组大鼠的心脏/体重指数高于假手术组,差异显著(P<0.01),说明心梗后慢性心衰而引起的心脏肥大;心衰组大鼠的肺/体重指数高于假手术组(P<0.01),提示有心力衰竭引起的肺水肿,见表2。1.3心肌梗死诱导普通性心梗面积占左室面积的比例观察心脏病理组织学变化,并采用Image-ProPlus6.0软件面积法测定该心脏心梗面积占左室面积的比值,该比值≥30%为冠脉结扎术诱导心衰模型成功标志。见表2。2肾市场导向,肾神经放电总参数表3中可以看出,HFAT1组大鼠与shamAT1组比较,前者肾交感神经放电活动明显减弱(P<0.05),HFAT2组与shamAT2组比较,肾交感神经放电无显著变化,各组大鼠注射药物前后HR和MAP均有改变,但无明显差异。图1显示,肾交感神经的放电活动在AT1受体阻滞剂L-158809注射后,手术组和假手术组大鼠都有减弱趋势,手术组减弱较假手术组减弱更为明显,见图1A、B。肾交感神经的放电活动在AT2受体阻滞剂PD123319注射前后手术组与假手术组改变不明显,见图1C、D。心功能损害机制本研究使用SD大鼠冠状动脉左前降支结扎导致心梗从而诱导慢性心衰动物模型,4周后可见,心衰组心脏/体重比与肺/体重比指数均高于假手术组,且有统计学意义;心衰组大鼠LVEDP较假手术组明显增高,差异有统计学意义;心脏病理组织学变化显示梗死面积>30%(梗死面积为49.5±8.5),有统计学意义,表明心衰模型制作成功。据相关文献报道,心力衰竭时循环内分泌激活,可加速心力衰竭的恶化,慢性心衰大鼠肾交感神经活性明显高于假手术组,这与我们的研究结果相一致。从我们的结果中可见,手术组RSNA在注射AT1受体阻滞剂L-158809后比注射前明显减弱,而假手术组减弱不明显;手术组注射AT2受体阻滞剂PD123319前后改变不明显,而假手术组亦无相关改变。PVN是自主性和内分泌性反应的重要整合中枢,在维持心血管活动的动态平衡中起着关键作用。心衰时PVN中AT1受体介导的血管紧张素反应对交感神经功能的调节有重要的作用。心衰大鼠PVN内AT1受体上调,使用AngII可明显引起肾交感放电的增强。本研究中,AT1受体阻滞剂影响了AngⅡ受体介导的交感信号的输出,阻断了相关兴奋性信号的转导,从而抑制了肾交感神经的放电。最近,Gao等发现,心衰大鼠中RVLM内AT1受体蛋白的表达明显升高,而AT2受体蛋白表达明显下降,AT1/AT2受体比例上升。