脾虚证与脑肠肽关系的形态学研究

脾虚证与脑肠肽关系的形态学研究

中医的“脾”与循环系统密切相关。脾虚时，消化功能紊乱。而脑肠肽除通过肠神经系统和体液因素,还可在中枢水平调节胃肠功能。因此,研究脾虚证与脑肠肽的关系对探讨脾虚证的本质有重要意义。本实验在以前有关脾虚证与下丘脑SS、MOT、CCK含量关系的研究基础上,首次从形态学角度就脾虚证与SS、MOT、CCK样免疫反应神经元的关系进行探讨。1动物分组、模型制备和免疫组化染色动物雄性SD大鼠25只,体重250±20g,本校实验动物中心提供。药物与试剂四君子汤、六味地黄汤均由本院中药房提供,将药物于清水中浸泡30分钟,煮沸后,文火煎30分钟,再浓缩至3g/ml浓度。利血平(1mg/ml)上海医科大学红旗制药厂提供。兔抗大鼠SS、CCK、MOT抗体均由第二军医大学神经生物教研室提供;SABC试剂盒由博士德公司提供;DAB由Sigma公司提供。动物分组及脾虚动物模型的建立25只大鼠,随机等分为5组:①正常对照组,每只每天股四头肌注射生理盐水0.2ml,同时灌服蒸馏水2ml,共14天;②脾虚模型Ⅰ组,每只每天股四头肌注射利血平0.3mg/kg,并灌服蒸馏水2ml,共7天;③脾虚模型Ⅱ组,造模方法同脾虚模型Ⅰ组,连续处理14天;④四君子汤组和六味地黄汤组,在用利血平(用法用量同上)的同时分别灌服四君子汤和六味地黄汤2ml/d,共14天。标本收集脾虚模型Ⅰ组于造模第7日,其余各组于造模的第14日,大鼠侧脑室注射0.6%秋水仙碱生理盐水溶液20μl,存活24小时,禁食不禁水12小时,次日上午8时至9时,戊巴比妥钠40mg/kg腹腔麻醉后Bouin液灌注固定。取脑组织,后固定2小时,然后入30%蔗糖磷酸缓冲液至组织块沉底。免疫组化染色脑组织于恒冷箱切片机做连续冠状冰冻切片,片厚30μm。参考王平宇《大鼠脑读片提要及图谱》,从经髓纹弯断开平面至经海马初现平面隔2张取2张分别做CCK、SS染色;从髓纹下段消失平面至海马齿状回互包平面,隔3张取1张做MOT染色。用SABC法进行染色,SS、CCK、MOT抗血清工作浓度均为1∶2000。同时用正常兔血清和PBS分别取代3种抗血清做替代及空白对照,染色结果均为阴性。每只动物SS、CCK和MOT分别染6张切片,各选其中染色较好的4张切片在10×10倍数下计数每张切片在下丘脑的染色阳性细胞数,4张切片总数除以4为该只动物的数值。采用双侧t检验进行组间差异的比较。2cck神经元光镜观察和测定动物行为表现脾虚模型组动物在肌注利血平后的表现同文献。四君子汤组与正常对照组比较无明显差别。六味地黄汤组则与脾虚模型Ⅱ组改变类似。神经元染色形态学观察:典型SS神经元胞体着深蓝色,胞核不着色,胞体发出1~3个细长突起,有部分细胞的胞核被反应产物掩盖。主要分布于室周核、室旁核、弓状核、腹内侧核、视交叉上核等核团。MOT神经元胞体内有颗粒状蓝色反应产物,胞核为空白或淡染区。胞体以圆形、椭圆形、梭形、蝌蚪形多见,部分细胞有1~2个细长突起,主要分布于室旁核和弓状核,CCK神经元胞体内有蓝色反应产物,胞核为空白或淡染区。胞体以圆形、椭圆形、梭形、蝌蚪形多见,部分细胞有1~2个细长突起。主要分布于室旁核与视上核,在室旁核CCK阳性胞体呈环状排列。光镜下SS、MOT、CCK神经元的测定见表1:与正常对照组相比,SS、MOT神经元数在脾虚模型Ⅰ组增加(P<0.01);脾虚模型Ⅱ组降低(P<0.01)。而CCK阳性神经元数在脾虚模型Ⅰ组和Ⅱ组均显著增加(P<0.01)。四君子汤组无明显改变,六味地黄汤组与脾虚模型Ⅱ组变化类似。3虚证和cck神经元的关系下丘脑的主要功能是调控内分泌系统,同时它又是大脑皮层下自主神经系统的调控中枢,在控制全身内脏功能方面起着重要作用。中枢神经系统内有一部分具有分泌功能的细胞,它们兼有神经细胞和内分泌细胞的特性。它们可被电兴奋,对高级神经中枢的神经冲动和神经递质起反应,同时它们又具有分泌功能,能合成激素性物质,并将这些神经激素释放入血,对其它部位发挥生理效应。神经内分泌细胞的发现打破了神经系统和内分泌系统不可逾越的概念。正常条件下中枢神经系统中绝大多数神经肽在神经元胞体中的含量极少,需用秋水仙素破坏轴突的微管系统,阻断轴浆运输,使神经肽集积于神经元胞体中,免疫组织化学技术才能显示它。有关脾虚证与下丘脑SS、MOT和CCK神经元关系的研究尚未见报道。脾虚证与SS神经元的关系SS神经元胞体主要位于视前区、下丘脑第三脑室前部室周区、弓状核、室旁核内侧小细胞部、视交叉上核及腹内侧核等,本实验显示,SS神经元的分布与有关文献报道一致。脾虚早期SS神经元数显著增加,表明参与SS合成的神经元数增加,即有部分在正常情况下未参与激素合成的细胞在脾虚早期开始合成SS,脾虚后期SS阳性细胞数下降,表明参与激素合成细胞减少,即有部分细胞的合成功能被抑制。我们前文观察到SS在下丘脑含量脾虚早期升高,脾虚晚期减少可能与此有关。脾虚证与MOT神经元的关系本实验显示,MOT神经元主要分布于视旁核与弓状核,与HarlanRE报道一致。脾虚早期MOT神经元数升高,说明参与合成的神经元数增多,脾虚后期,MOT神经元数下降,说明参与合成的神经元数减少,这可能是我们以前研究所观察的MOT在下丘脑含量脾虚早期升高,脾虚晚期下降的原因之一。脾虚证与CCK神经元的关系CCK神经元为大细胞或小细胞,主要分布于室旁核、视上核、室周核及室交叉上核等。本实验显示的CCK神经元的分布与有关文献报道一致。脾虚早期、晚期CCK神经元数均显著增高,说明参与合成的神经元数增加,这也是与我们以前观察到的脾虚早期、晚期下丘脑CCK含量均增加相符合的。李泽桂研究发现,烫伤应激大鼠下丘脑CCK增加,相应室旁核CCK免疫反应性细胞的平均总面积大于对照组,第三脑室室管膜CCK免疫反应性细胞数增多,与本研究的结果类似。四君子汤预防性治疗组SS、MOT和CCK神经元细胞数均无明显变化,说明四君子汤对该三种神经元的合成功能具有调整作用。六味地黄汤组与脾虚Ⅱ组改变类似,说明六味地黄汤对这三种神经内分泌细胞的合成功能无调整作用。以方测证表明该脾虚动物模型是可信的。同时也为阐明四君子汤的健“脾”作用机理提供了实验依据。综上所述,脾虚造模早期下丘脑参与SS、MOT和CCK合成的神经元均增多,脾虚造模晚期下丘脑参与SS和MOT合成的神经元数减