分子生物学课件：第四章 PCR技术与DNA测序

第四讲PCR技术与DNA测序背景知识分子生物学是一门实验科学，非常注重实验操作的学科，在其发展历史上，几乎每一次重大理论的发现与突破都离不开新技术、新方法的支撑。分子生物学技术也是在分子水平上开展生物医学研究的共同工具，一些技术还广泛用于临床疾病的诊断与治疗等。掌握和了解一些常用的分子生物学技术，不仅有助于进一步加深理解分子生物学的理论知识，而且对于在分子水平上深入认识疾病的发生和发展机制、理解和应用基于分子生物学的诊断和治疗方法极有帮助。分子生物学技术的种类非常繁多，但按照其复杂性程度不同则可将其大致区分为基本技术和延伸拓展类技术两大类：

1.基本技术：包括核酸的分离纯化、PCR技术、分子杂交与印迹技术、各种分子酶学操作等。

2.延伸拓展类技术：包括DNA重组技术、测序技术、生物芯片、转基因动物、RNA干扰技术等，此类技术从本质上来讲一般都是在前述基本技术的基础上建立的。

PartI

PCR技术P402聚合酶链（式）反应（Polymerasechainreaction,PCR）知识体系PCR技术简史原理反应体系技术特点结果检测衍生技术一、PCR技术简史PCR技术，是上个世纪80年代发展起来的一种在体外对特定的DNA片段进行高效扩增的技术。应用这一技术可以将特定的微量靶DNA片断于数小时内扩增至十万乃至百万倍。PCR技术的创立对于分子生物学的发展具有不可估量的价值，它以敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等优点迅速成为分子生物学研究中应用最为广泛的方法，极大的推动了分子生物学本身以及整个生物医学的快速发展。PCR技术当之无愧是生物医学领域中的一项革命性技术创举和里程碑。PCR的实现

1985年,Mullis等

PCR技术是于1985年由时任美国PE-Cetus公司的技术人员KaryMullis建立。但事实上，早在1971年，KjellKleppe等描述的一项基于酶的体外DNA复制实验，实际上已经触及PCR技术原理的本质。但遗憾的是，这在当时并没有引起人们足够的重视，而这也恰好成为日后PCR专利之争的一个起因。

PCR的实现

1985年,Mullis等

1985年，Cetus公司的日裔人员RandallSaiki等在Science杂志首次发表了将PCR用于镰刀状贫血基因诊断的论文。1987年7月，PCR技术在美国获得了专利批准，为Cetus公司所有。同年，Cetus公司和Perkin-Elmer公司合资开发生产用于PCR的DNA热循环仪。药业巨头瑞士Roche公司于1992年以三亿三千五百万美元的天价购买了Cetus公司的PCR专利。PCR的实现

1985年,Mullis等

由于Mullis最初使用的DNA聚合酶在高温下失活，需要每轮反应添加新鲜的DNA聚合酶，花费巨大而且费时费力。后来Cetus公司根据台湾学者钱嘉韵的研究成果，成功分离出耐高温的TaqDNA聚合酶，并将其成功用于PCR。此酶的发现和应用成为PCR技术自动化的关键性“临门一脚”，使得PCR技术迅速得以广泛推广。PCR的实现

1985年,Mullis等

1993年，Mullis因PCR的发明获得诺贝尔化学奖，正如TimAppenzella在评论中所述：PCR确实仅仅是实验中的一个小技巧（trick），与以往的诺贝尔奖研究项目相比，其中的知识和智慧含量似乎并不丰富；但是无论如何，PCR对于分子生物学的影响远远超过了其它所有的技术。提高效率的思路双链单链循环DNA聚合酶仪器改进高温低温PCR的改进与完善

大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段

T4DNA聚合酶

TaqDNA多聚酶

二、PCR技术的基本原理PCR技术的基本原理类似于DNA的体内复制过程，即以拟扩增的DNA分子为模板、以一对分别与模板5'-末端和3'-末端相互补的寡核苷酸片断为引物、以四种dNTP为原料、由DNA聚合酶按照半保留复制的机制沿着模板链延伸而合成新的DNA，不断重复这一过程，即可使目的DNA分子得到扩增。AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链DNA

复制过程中形成的复制叉子代DNA

参与DNA复制的物质底物(substrate):

dNTP——加入聚合酶(polymerase):DNA聚合酶——分离模板(template):DNA母链——提取引物(primer):——人工合成其他的酶和蛋白质因子——Mg2+,PCR仪图：PCR反应过程PCR反应的基本原理示意图3’

TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG…GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT5’5’ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATCCTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA3’

变性（950C，30s）3’TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAGGATCTATCCAACGGCTAGGCATTT5’5’ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC…CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA3’退火（450C～550C，30s～1min）5’ataagcccgaaaggt3’3’aacggctaggcattt5’TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAGGATCTATCCAACGGCTAGGCATTTATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATCCTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA5’ataagcccgaaaggttcgtccaacggctaggcattt5’延伸（720C，1～几分钟）TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAGGATCTATCCAACGGCTAGGCATTTataagcccgaaaggttcgttGATCCTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAAATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATCCTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAATATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAGGATCtatccaacggctaggcattt循环25～305′3′5′3′目的DNA扩增106-7倍

类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：1.基本原理②退火（annealing）（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，将温度降至引物的Tm值左右或以下（55℃左右），引物与模板DNA单链的互补序列配对结合，形成杂交链。①变性（denature）：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。③延伸(extension)：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。

以上三步为一个循环，约需2～4分钟，每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此循环30次，大约2～3小时后，新生DNA片段理论上可达到2n-1个分子拷贝。5

Primer15

Primer2Cycle2Cycle15

5

5

5

5

5

TemplateDNA5

5

5

5

5

5

5

5

目的片段？？？Cycle35

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

25～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。1.标准的PCR反应体系（50～100ul）

三、PCR反应体系与反应条件10×缓冲液

buffer

1/10体积

4种dNTP混合物各200μmol/L

引物Primer1,2(上,下游)各1μmol/L

模板DNA

102

～105

拷贝TaqDNA聚合酶1～5μ

l

Mg2+

1.5mmol/L

双蒸水ddH2O至50～100

μ

l2.PCR引物设计两条引物，即5′端引物和3′引物。以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准）TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAGGATCTATCCAACGGCTAGGCATTTATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATCCTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA5’ataagcccgaaaggttcgtccaacggctaggcattt5’5′3′5′3′基准（编码链）①引物长度：15-30bp，常为20bp左右。②引物碱基：ATGC最好随机分布。③引物内部不应出现互补序列。④两个引物之间不应存在互补序列。引物设计的基本原则：⑤引物与非扩增区序列不要超过70%相同。⑥引物3′端的碱基应严格要求配对，最佳选择是G和C。⑦引物的5′端可以修饰。几种常见引物设计缺陷引物设计软件PrimerPremier5.0（自动搜索）*Oligo6（引物评价）VectorNTISuitDNAsisOmigaDNAstarPrimer3（在线服务）3.模板的制备PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。标本处理的基本要求是除去杂质。四、PCR反应特点

决定因素为：①引物与模板DNA特异正确的结合；（关键）②碱基配对原则；③TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性。1.特异性强3.简便、快速

4.对标本的纯度要求低2.灵敏度高五、PCR扩增产物的分析

1.凝胶电泳分析琼脂糖凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳紫外线/灯下观察结果594bp600bp2652bp800bp50bp350bpM123HCMVPCR产物电泳分析结果PCR扩增结果2.酶切分析

3.分子杂交

4.核酸序列分析

酶切结果酶切结果六、常用的PCR衍生技术1.逆转录PCR

（reversetranscriptionPCR,RT-PCR）（1）概念：是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术，也称反转录

PCR。模板———RNA原料———dNTP引物逆转录酶产物———互补的DNA链实质———复制（2）参与逆转录反应的要素2.逆转录酶多功能酶：①RNA指导的DNA聚合酶活性；②RNA酶H（RNaseH）活性，能特异性水解RNA-DNA杂交体上的RNA；③具有DNA指导的DNA聚合酶活性④没有3′5′外切酶活性☆细胞总RNA的检测

1.TotalRNAextractedfrom293transfectedwithpAd-CMV-E6/E72.TotalRNAextractedfrom293transfectedwithpAd-K14-E6/E7

3.RT-PCR的反应体系MgCl24μl（5mmol/L）Buffer2μl（1×）dNTP混合物8μl（1μmol/L）RNase抑制剂0.5μl（1u/μl）反转录酶1μl（0.25u/μl）引物1μl（2.5μmol/L）总RNA1μl（1μg）无RNase的dH2O至总体积20μl逆转录体系逆转录反应在420C进行1h后，加热至950C5min，灭活逆转录酶。取2μl反应产物，按DNA为模板的PCR反应步骤，进行扩增反应。☆

HPV-16E6/E7在转录水平的RT-PCR检测结果

1.Marker：100bpDNAMarker;2.RT-PCR产物：E6/E7基因;3.阴性对照

RT-PCR鉴定pAd-CMV-E6/E7转染的293细胞中E6/E7的表达

2.巢式PCR先用一对外侧引物扩增含目的基因的大片段，再用内侧引物以大片段为模板扩增获取目的基因。筑巢PCR可以提高PCR的效率和特异性。适于模板含量较低的样本。目的片段第一轮PCR第二轮PCRCG二核苷酸是最主要的甲基化位点。C-CH3G——C-CH3G

引物1：GCCG——UG

TG

引物2：

AC3.甲基化特异性PCR——检测甲基化4.多重PCR—多个PCR同时进行在一次反应中加入多对引物，由于每一对引物与模板DNA的不同片段相结合，因而扩增片段长短不同。由此可检测是否存在某些基因片段的缺失或突变。片段1片段25.原位PCR—PCR技术与原位杂交结合在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点。在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列。①固定组织或细胞②蛋白酶K消化处理③PCR扩增：原位PCR仪④杂交⑤显微镜观察结果原位PCR仪——玻片常规PCR仪——扩增管6.定量PCR广义概念的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。狭义概念的定量PCR技术（严格意义的定量PCR技术）是指用外标法（荧光杂交探针保证特异性）通过监测PCR过程（监测扩增效率）达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果(扩增效率为零)。

实时荧光定量PCR技术（real-timePCR），是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。荧光定量PCR所使用的荧光化学发光可分为两种：

①荧光探针

②荧光染料

①

TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。②SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。扩增曲线：4个阶段②Ct值（循环阈值，Cyclethreshold）：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数荧光域值（threshold）：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：荧光信号开始由本底信号进入指数增长阶段的拐点时的荧光信号强度。荧光阈值循环次数③Ct值与起始模板的关系每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。七、PCR技术的应用目的DNA的获得核酸定量分析临床医学：遗传病、病原体、基因诊断法医学动植物检疫食品安全：转基因检测PartIIDNA测序技术（DNAsequencing，DNA序列测定）P415

DNA的测序是分子生物学研究中非常重要和关键的内容。DNA序列测定方法：1.Sanger的双脱氧法：A/T/G/C四个反应。2.化学降解法：G反应；G+T反应；T+C反应和C反应。3.自动测序法。DNA测序的主要方法有两种，即双脱氧链终止法（Sanger法、酶促法）和化学裂解法（Maxam-Gelbert法）。二者均依赖于高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。一、Sanger双脱氧链终止法（一）原理(单链)DNA链中的核苷酸是以3`，5`-磷酸二酯键相连接，合成DNA所用的底物是2`-脱氧核苷三磷酸（dNTP），在Sanger双脱氧链终止法中被掺入了2`，3`-双脱氧核苷三磷酸(ddNTP),当ddNTP位于链延伸末端时,由于它没有3`-OH，不能再与其它的脱氧核苷酸形成3′,

5′-磷酸二酯键，DNA合成便在此处终止，如果此处掺入的是一个ddATP，则新生链的末端就是A，依次类推可以通过掺入ddTTP、ddCTP、ddGTP，则新生链的末端为T、C或G。Sanger1977年双脱氧核苷三磷酸互补链合成过程233基于DNA聚合酶的催化特性：①以DNA为模板，形成正确的模板DNA互补链；②能以dNTP作为底物，也能利用ddNTP作底物。

在4组独立的DNA合成反应中，分别加入4种不同的ddNTP，结果将生成4组核苷酸链，它们将分别（随机）终止于每一个A，每一个G，每一个C，每一个T的位置上。对这4组核苷酸链进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列。Sanger双脱氧测序方法示意图+G+ddGGATTCGGATTCddGGATTCGAGGATTCGAddGGGG引物电泳双脱氧法测序原理示意图①设置4个反应②各反应加入待测DNA、引物、DNA聚合酶I（失去5′3′外切核酸酶活性）、dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）③每管分别加入1种ddNTP

（如ddTTP、dTTP）。ddTTP的比例很小（1:10）④掺入的位点是随机的⑤引物末端用放射性核素标记归纳如下：二、Maxam-Gilbert化学修饰法基本原理：用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割，由此产生一组具有各种不同长度的DNA链的反应混和物，经凝胶电泳按大小分离和放射自显影，便可根据X线片底板上显示相应带谱，直接读出待测DNA片段的核苷酸顺序。

化学修饰法的待测DNA片段有的是双链，有的是单链DNA。在进行碱基特异性化学切割反应前，首先对待测DNA片段作末端标记，使其末端(5′端或者是3′端)带上放射标记。如果待测DNA是双链，必须使其形成末端标记的单链。对末端标记的DNA链进行化学断裂反应分两步进行：第一步是在4个反应管中分别以肼、硫酸二甲酯(DMS)和甲酸对特定的碱基进行化学修饰；第二步是以六氢吡啶取代被修饰的碱基并将DNA链断裂。DNA化学裂解反应体系反应体系碱基修饰试剂碱基修饰反应主链断裂试剂断裂点G硫酸二甲酯鸟嘌呤甲基化六氢吡啶

GG+A