全骨髓培养分化为成骨细胞的成骨细胞的培养及鉴定

全骨髓培养分化为成骨细胞的成骨细胞的培养及鉴定

种子来源是组织工程的基本问题。骨块、骨膜、骨髓经体外培养均可为组织工程骨提供成骨细胞。骨髓取材方便,来源广泛,骨髓中的间充质干细胞(marrowmesenchymalstemcells,MSCs)经定向诱导可分化为成骨细胞,已被大量动物实验证实。我们在一系列动物实验的基础上,定向诱导人MSCs分化为成骨细胞获得成功,并对其成骨特性进行鉴定,报告如下。1材料和方法1.1腰椎弓根峡部裂1例18岁,诊断为先天性脊柱侧弯;另1例12岁,诊断为椎弓根峡部裂。两例经血、尿分析无代谢性骨病,肝、肾功能正常。术前经患者同意,于术中取髂骨植骨时,从髂后上棘抽取骨髓5ml,吸入预先加有0.5ml肝素的无菌针管备用。1.2免疫药物及试剂DMEM高糖培养基、胰蛋白酶均为Gibco产品,β-甘油磷酸钠、抗坏血酸均为Sigma产品,胎牛血清(杭州三利)。鼠抗人Ⅰ型胶原单克隆抗体及免疫组织化学试剂盒(中山生物技术有限公司),地高辛标记骨桥素、骨连接素mRNA探针及原位杂交检测试剂盒(北京大学病理系提供)。硝酸钴、硫化胺等试剂(北京化学试剂厂)。完全培养基的组成:DMEM培养基加入10%胎牛血清,青、链霉素终浓度为100U/ml。条件培养基组成:在完全培养基中加入地塞米松、抗坏血酸及β-甘油磷酸钠,终浓度分别为10-8mol/L,50μg/ml,10mmol/L。1.3培养条件培养基在预试验的基础上,结合全骨髓法和离心法的优点,采取以下培养方法:将抽取的骨髓分装入离心管中,加入DMEM完全培养基1.5ml,1500r/min离心15分钟,吸取上清及少量沉淀的血细胞,移至无菌培养瓶中,补足完全培养基,37℃,5%CO2孵箱培养。倒置显微镜每日观察。5天后半量换液,第10天当观察到少量细胞变为梭形、贴壁,即全量换液,改为条件培养基,此后每3～4天换1次条件培养基。倒置显微镜隔日观察,直至细胞不能传代、衰老死亡为止。1.4免疫组织化学1cm2盖玻片用洗涤灵清洗干净,泡酸24小时,水洗10遍以上,过蒸馏水,95%酒精浸泡过夜,蒸馏水洗2遍,高压灭菌,铺于24孔板底备用。培养瓶中细胞接种后第20天铺满瓶底。0.25%胰酶消化、传代。取第3代细胞计数,以5×105/ml接种于孔底预先铺好玻片的24孔板,3天后细胞长满玻片,取出玻片,作以下处理:①95%酒精固定10分钟,碱性磷酸酶(alkalinepohosphatase,ALP)钙-钴法染色,观察阳性细胞百分比:随机抽取6张爬片,每张片随机观察500个细胞,计数其中ALP染色阳性者并计算平均值和百分比。②10%中性福尔马林溶液固定30分钟,Ⅰ型胶原免疫组织化学检测及VonKossa染色。免疫组织化学一抗为鼠抗人Ⅰ型胶原单克隆抗体,DAB显色。③纯丙酮-20℃固定20分钟,原位杂交检测骨桥素(osteopontin,OP)、骨连接素(osteonectin,ON)mRNA表达。所有检测项目均以成纤维细胞系PT67细胞作阴性对照。2结果2.1胰酶消化传代增殖特征MSCs接种后,因混杂少量血细胞呈浑浊状态,无法分辨成分。静置培养5天后半量换液,骨髓中的造血干细胞随换液被部分除去,可见大量单核细胞,圆形、未完全贴壁(图1);8天后可见个别单核细胞贴壁,变成梭形或多角形(图2);10天后变形细胞逐渐增多并连接成片,形成多个成纤维细胞集落;14～18天细胞集落间互相融合成单层,胰酶消化传代后细胞均匀生长,排列整齐,多呈长梭形,较薄、有突起,突起的个数及形态各不相同(图3)。细胞连续传代可达10代。4代以前生长迅速,平均4～5天传代1次;5代以后增殖变慢,7～8天传代1次;至第9代,经10天才长满瓶底,同时伴有细胞的崩解、死亡。2.2alp钙-钴法染色可见胞浆中有大量黄褐色颗粒,阳性细胞平均占细胞总数的85%(图4)。PT67细胞胞浆未见染色。2.33亚洲鉴定胶伤口免疫组可见胞浆中出现大量黄褐色颗粒,为阳性反应(图5)。PT67细胞阴性。2.4cosa染色MSCs经诱导培养,可形成钙结节,VonKossa染色可见细胞聚集的部位出现黑色结节(图6)。PT67细胞未见结节。2.5相同位置下的混合检测地高辛标记的OP、ONmRNA探针原位杂交胞浆中出现大量蓝色颗粒,为阳性反应(图7、8)。PT67细胞阴性。3mscs的诱导分化干细胞是个体发育过程中产生的具有多向分化能力的一类细胞,根据来源可分为胚胎干细胞和组织干细胞。目前已发现的组织干细胞包括造血干细胞、MSCs和神经干细胞,存在于人和动物成熟组织中,具有高度更新能力和多向分化潜能。其中MSCs具有向多种中胚层和神经外胚层来源的组织细胞分化的能力,如成肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞和成神经胶质细胞等。由于同源MSCs移植具有不发生免疫排斥反应(或程度较轻)、来源广、取材方便的优点,在临床组织缺陷性疾病的细胞替代治疗和基因治疗中有巨大的应用价值,同时也成为组织工程骨种子细胞的最佳选择。自从Maniatopoulos等1988年首次报道鼠MSCs经体外培养可形成钙化的骨样组织以来,从动物骨髓诱导分化成骨细胞已不困难。由于种属的差异,人MSCs分化为成骨细胞的条件仍在研究之中。而组织工程骨应用于临床及进行人的骨病理生理研究必须以培养人的成骨细胞为前提,为此,我们在体外分离培养了人MSCs,并对其诱导分化的条件进行了研究,以期建立一套人MSCs诱导分化为成骨细胞的方法。我们的实验结果表明,体外培养的人MSCs在适当浓度的地塞米松、抗坏血酸及β-甘油磷酸钠的作用下可定向分化为典型的成骨细胞。这种细胞具有较高的ALP活性,产生Ⅰ型胶原,分泌OP和ON,在条件培养基中可产生矿化的细胞外基质。既往研究表明,地塞米松可促进成骨细胞分化成熟,诱导成骨,还可调节成骨样细胞合成胰岛素样生长因子,促进胶原的合成,刺激ALP的活性。β-甘油磷酸钠可提供磷离子作为ALP作用的底物,诱导和激活ALP,促进有机磷向无机磷转化,加速钙盐沉着。抗坏血酸可使基质细胞维持较高的ALP活性。骨髓成骨细胞的培养方法有全骨髓法和离心法。全骨髓培养法是将抽取的骨髓不经任何处理加入培养基制成细胞悬液培养,其中的造血干细胞可随换液被逐渐清除;离心法是通过淋巴细胞分离液提取单核细胞层进行培养,视野清晰,便于早期观察。我们曾对这两种方法进行了尝试,结果发现全骨髓法单核细胞贴壁早、增殖快,约早于离心法2～3天。推测可能是由于造血干细胞中存在丰富的黏附因子和促增殖因子所致。但此法早期视野不清,无法详细观察细胞情况。我们结合两种方法的优点,1500r/min离心后,在分离上清的同时吸取少量沉淀的血细胞进行混合培养,既保证了多种黏附因子和生长因子的存在,又有利于早期的观察,取得了较好的效果。我们的研究还发现,人MSCs经诱导生成的矿化结节是连续的,而鼠MSCs在同样培养条件下生成的矿化基质是不连续的,呈岛状,与未矿化细胞群间隔分布,这与Bellows等的研究结果一致。提示种属间的差异在MSCs的培养中是不容忽视的。我们的实验采用人骨髓为培养材料,建立起人MSCs诱导分化为成骨细胞的方法,不仅为组