环境微生物研究的分子生物学方法

环境微生物研究的分子生物学方法

微生物在环境管理过程中起着非常重要的作用。环境微生物研究的重要内容是对微生物群落的种群分布、遗传多样性和动态变化规律的认识。传统的微生物群落分析法建立在微生物遗传改良的基础上，但环境中超过99%的微生物无法人工培养，这给微生物的分析和研究带来了很大的障碍。近年来，研究人员开始采用生物技术分析环境微生物，并克服了传统方法中不能清晰分类和不能培养菌群的缺点。本文主要介绍了在研究环境微生物群落多样性、微生物群落动态变化规律等领域中较为常用的4种分子生物学技术的基本原理和操作过程及其应用概况.1原光源混合技术fish1.1fish技术用于检测16srrna的分子微生物细胞内的核糖体RNA(rRNA)含有特异区和高度保守区,对物种的进化有指示性作用,被称为微生物体内的“活化石”.其中16SrRNA的分子结构高度保守,只有某些位置有少量具有种属特异性的核苷酸序列的改变,根据16SrRNA序列的保守性和特异性可按不同分类级别设计所需要的寡核苷酸探针.FISH技术使用的就是(16~23)SrRNA寡核苷酸探针,其一般进行荧光标记20bp左右的特异性核苷酸片段.利用该探针与固定的组织或细胞中特定的核苷酸序列进行杂交.1.2细菌处理及清洗该技术主要操作步骤包括:(1)活性污泥的预处理:革兰氏阳性细菌用50%乙醇溶液,革兰氏阴性细菌用4%多聚甲醛处理;(2)样品在载玻片上固定并用乙醇脱水;(3)寡核苷酸探针杂交:一般在46℃下杂交1~3h;(4)样品清洗:用48℃水浴的清洗液及冰浴的超纯水清洗;(5)封片观察.通常要结合使用一些通用的寡核苷酸探针对微生物样品进行区域界定及不同分类级别的区分.1.3生物除磷改性FISH技术的突出特点是克服了纯培养的技术限制,在原位水平进行探测和分析环境中微生物群落的组成及演替规律、以及不同种群的空间联系等生态学变化规律.近年来,该技术大量用于污水处理系统中微生物的研究,如Juretschko和Schramm等采用FISH技术对硝化流化床的活性污泥中硝化细菌的多样性进行了跟踪分析;德国学者Wagner对8个污水处理工艺(以生物除磷为主)的生物多样性进行了FISH探测,取得了很好的效果.当然该技术也存在一些问题,如荧光信号弱、清晰度差;还有一些种类的微生物细胞壁穿透性差,使探针不能充分进入细胞内与rRNA分子杂交;另外,一些生长缓慢的细胞由于rRNA含量低而很难被探测到.2非线性梯度沉积电泳dgge技术2.1双链dna分离变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)技术在微生物生态学研究中的应用已逾10年,是利用在含有浓度线形递增的变性剂(尿素和甲酰胺的混合物)的聚丙烯酰胺凝胶电泳中,将长度相同但碱基排列顺序不同的双链DNA分离.该技术以带GC夹子(G和C碱基集中的序列)的引物扩增PCR产物在由上(正极)向下(负极)DNA变性剂浓度递增的垂直电泳胶上泳动,随着DNA变性剂浓度的递增,双链DNA间的氢键断裂、解链成单链,而GC堆积部分的氢键坚固,仍保持双链结构,最后DNA分子呈三向延伸的形状.这种形状的DNA分子的电泳迁移率随DNA分子序列中A-T、G-C的排列和氢键数量的不同而不同,使具有相同碱基序列的DNA分子集中在一处形成条带,其他其它DNA分子在别处形成条带,这就使长度相同而序列不同的DNA片段在胶上分离.2.2总dna的提取及pcr扩增该技术主要操作步骤包括:(1)从环境中取得样本,如地下水、活性污泥、生物膜等,进行微生物总DNA的提取;(2)通过聚合酶连锁反应(PCR)将提取的总DNA中的特定序列进行扩增,其扩增产物利用DGGE进行分离;(3)对DGGE带进行测序并鉴定分析或者被印渍在尼龙膜上与标记的寡核苷酸专一性探针进行杂交,鉴定群落成员.2.3微生物多样性分析DGGE技术具有分辨率高,能够检测出只存在单碱基差异的突变个体;加样量小;重复性好;耗时少,和操作简便、快速,可同时检测多个样品等显著优点,使得人们对复杂微生态系统的解析成为可能,是一种非常适合分析废水生物处理过程中微生物群落的多样性及动态变化的基因指纹技术.Murray等采用PCR-DGGE比较2个江口的浮游细菌的系统多样性.Zwart等通过巢式PCR-DGGE分析了荷兰温水湖中Verru-comicrobiales的多样性,并且证实湖中全年都存在这些菌.3末端限制酶段的多态性分析t-rc3.1比较微生物群落结构与功能的检测T-RFLP技术以分子系统学原理为基础,综合运用PCR技术、DNA限制性酶切技术、荧光标记技术和DNA序列自动分析技术,在DNA水平上通过对特定核酸片段长度多态性的测定来分析比较微生物群落结构和功能.首先根据比较基因组学原理选取一段具有系统进化标记特征的DNA序列作为目标分析序列,之后根据目标基因序列的保守区设计引物,荧光标记,检测带荧光标记的片段(TerminalRestrictionFragment,T-RF).通过对这些荧光信号以及由此生成的T-RFLP图谱的分析,就可以揭示样品中微生物的种类、数量和种群大小等,从而解析微生物群落的结构、功能及其动态变化.3.2图1显示了t-rlp技术的操作过程t-rlp技术的操作过程3.3t-rflp技术的缺陷大量研究表明,T-RFLP技术分析复杂的微生物群落结构具有很高的分辨率,适合对微生物群落多样性分析评价,以及快速地研究、分析微生物群落的变化规律.在环境微生物研究中的应用见表1.当然,T-RFLP技术也存在一些问题:1)摆脱不了PCR技术共同的缺陷,例如群落中不同菌种DNA的差异性扩增,以及目标DNA在菌种间拷贝数的差异等等,造成分析结果难以准确反映自然群落的多样性以及物种间的相对丰度信息;2)该指纹印记技术只检测带荧光标记的末端限制性片段;3)酶切后T-RF的长度分布也会造成对复杂群落多样性的低估;4)实验过程影响因素众多,使得T-RFLP图谱的解析存在一定的不确定性;5)如何对大量T-RFLP数据进行处理和统计学分析,以挖掘出其中蕴含的微生物群落结构信息是目前T-RFLP技术研究的焦点之一,很多理论和技术上的问题仍处于摸索和逐步完善阶段.4基因芯片技术4.1微生物基因芯片基因芯片(Microarray)技术于1991年首次在Science杂志上被提出,是生物芯片(Biochip)的一种,,根据探针排列的类型,将可用于环境微生物研究的基因芯片分为3类:一、功能基因芯片(FunctionalGeneArrays,FGAs),含有编码不同生物化学循环过程关键酶和其他功能基因序列,可用于检测自然环境中微生物群落的生理状态和功能活动;二、寡核苷酸芯片(PhylogeneticOligonucleotideArrays,POAs),主要是用于微生物群落组成和结构的系统发育分析;三、群落基因组芯片(CommunityGenomeArrays,CGAs),该技术根据可培养的成分描述微生物群落结构.4.2探针检测芯片基因芯片技术用于环境微生物研究具1)DNA或寡核苷酸为基础的基因芯片技术允许研究者全面地研究不同条件下活细胞的生理学;2)该技术不需要知道保守序列,不同种群的同一功能组的所有多态性基因序列可以构建在芯片上,并且以此作为探针来检测它们在环境样品中的的相应分布;3)不需要枯燥费时的配对杂交;4)基因芯片需要的样品量少,适宜于环境微生物检测和5)基因芯片具有定量特性等优势,在环境微生物的生理生态、结构和功能的了解上具有广阔的应用前景.Rudi等构建了含有源于藻青菌的SSUrRNA探针的小芯片,并在低浓度和高浓度下分析了湖泊中藻青菌的存在和数量,表明探针对培养物的分析是特异性的.Valinsky等利用从土壤克隆文库中获得的16SrRNA构建基因芯片,分析比较了来自2个不同农业土壤的1536个16SrRNA克隆的指纹图谱,结果发现土壤中特殊的细菌种群与特异的植物病害抑制作用具有相关性.5传统技术与现代手段相结合应用的原则大量研