银杏多糖的提取及乙酰化法取代度的测定

银杏多糖的提取及乙酰化法取代度的测定

根据现代药理学实验，白银的生物活性主要与白银糖有关。真菌多糖生物活性的发挥与其结构密切相关,对多糖进行结构修饰可能会使其具有一些新的理化性质或生物活性,可作为研究多糖构效关系的有效方法,是目前多糖研究领域的热点之一。多糖结构的化学修饰主要是利用多糖分子中的羟基、羧基、氨基等活性基团进行化学反应以引入新的基团,如硫酸基、磷酸基、羧甲基、烷基等。乙酰化多糖的乙酰基能改变多糖分子的定向性和横次序,从而改变多糖的物理性质,乙酰基的引入使分子的伸展状态发生变化,导致多糖极性基团暴露,增加在水中的溶解性,同时乙酰基的数量和位置对多糖活性也有显著影响。银耳多糖乙酰化修饰还未见文献报道,因此本文以乙酸酐作为酰化试剂对银耳多糖进行化学修饰,研究建立了羟胺比色法测定乙酰化银耳多糖取代度的方法,其研究结果将会为银耳多糖进行构效关系探讨打下良好基础。1材料和方法1.1试剂与仪器银耳干品市售;苯酚、氢氧化钠、浓盐酸、盐酸羟胺、六水三氯化铁、醋酸钠、三氯甲烷、正丁醇、浓硫酸、乙酸酐、无水乙醇国产分析纯试剂;葡萄糖、氯化乙酰胆碱国产标准品;透析袋MW8000,美国联合碳化。GL-21M型高速冷冻离心机湘仪;UV-1800型紫外分光光度计、UV-2802PC型紫外扫描仪尤尼柯;FD-1C-55型真空冷冻干机北京博医康;FA2004B型电子天平上海天美;FZ102型微型植物试样粉碎机北京中兴伟业。1.2实验方法1.2.1水浸提取液制备银耳子实体70~80℃干燥2h,粉碎并过60目筛。室温条件下用乙醇(80%)搅拌浸泡银耳粉末12h,减压抽滤,滤饼用10倍体积70℃的水浸提5h,10000r/min冷冻离心10min,取上清液,并重复浸提1次。合并提取液,减压浓缩,向残余物中加入乙醇至终浓度80%,搅拌过夜,离心,收集沉淀,依次用无水乙醇、丙酮、乙醚依次充分洗涤,真空冷冻干燥,制得银耳粗多糖。1.2.2银耳多糖的检测采用Sevage法除去银耳多糖中的蛋白类杂质,向多糖水溶液中加入适量的Sevage试剂(三氯甲烷∶正丁醇=4∶1),剧烈振荡30min,10000r/min冷冻离心10min,去除沉淀,取上清液,重复上述操作,紫外扫描检测,直至银耳多糖溶液在260nm和280nm处无明显吸收,表示其中的蛋白类杂质已除尽。1.2.3标准曲线的制作葡萄糖标准品在105℃条件下干燥至恒重,精确称取0.2000g,蒸馏水溶解并定容至100mL,溶液浓度为2mg/mL,分别量取葡萄糖标准溶液2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0mL置于50mL容量瓶中,并定容至刻度配制标准溶液,浓度分别为0.08,0.10,0.12,0.14,0.16,0.18,0.20mg/mL。将50mL浓硫酸缓缓加入10mL水中冷却至室温,加入0.6g苯酚晶体搅拌使其溶解配成显色液。取1.00mL葡萄糖标准溶液或待测试样溶液置于试管中,加入5.00mL显色液,振荡混匀。置于沸水浴中保温30min,取出,放在冷水浴中,冷却至室温,于490nm处测定其吸光度值。1.2.4控制反应ph取0.50g银耳多糖溶解于10mL水中,用3%氢氧化钠调pH至11.0。室温条件下交替加入氢氧化钠溶液和乙酸酐,使反应溶液的pH控制在7.0~11.0范围内,直至3.0mL乙酸酐加完,25~30℃下反应液维持pH为8.0搅拌反应3h。反应结束后,用1.0mol/L盐酸中和反应溶液至pH=7.0,将反应液置于透析袋中,第1、2d自来水透析,第3d蒸馏水透析,3d后取出将内液减压蒸馏至小体积,加入少量蒸馏水溶解后进行真空冷冻干燥,研磨,得到乙酰化银耳多糖。1.2.5乙酰基取代度的测定1.2.5.药品及其他总氮酸钠标准品溶液A:盐酸羟胺溶液(2mol/L)取盐酸羟胺13.9g,加水定容至100mL,冷藏保存;B:氢氧化钠溶液(3.5mol/L):称取氢氧化钠14.0g,加水定容至100mL;C:盐酸溶液(4.0mol/L):取浓盐酸33.3mL,加水定容至100mL;D:三氯化铁-盐酸溶液(0.37mol/L):称取FeCl3·6H2O10.0g,加0.1mol/L盐酸溶液定容至100mL;E:碱性羟胺溶液:将等体积的盐酸羟胺溶液与氢氧化钠混合配制,现配现用;F:醋酸钠溶液(0.001mol/L):称取醋酸钠0.0205g配制成250mL溶液;G:氯化乙酰胆碱标准溶液:精确称取氯化乙酰胆碱标准品53.2mg,置于50mL容量瓶中,加0.001mol/L醋酸钠溶液溶解,定容,现配现用;H:样品溶液(0.218mg/mL):称取乙酰化银耳多糖54.5mg,置于50mL容量瓶中,加0.001mol/L醋酸钠溶液溶解,定容。1.2.5.2.标准曲线的制备1.2.5.乙酰化银耳多糖的取代度根据标准曲线得到乙酰化银耳多糖的乙酰基含量M1,按公式(1)先计算出乙酰化银耳多糖中乙酰基的百分含量W,再根据公式(2)计算乙酰化银耳多糖的取代度。式中,M1-乙酰化银耳多糖中乙酰基的质量(mg);M2-乙酰化银耳多糖的质量(mg);162-多糖每个糖单元相对分子质量;43-乙酰基相对分子质量;1-氢原子的相对原子质量。2结果与分析2.1银耳多糖的纯化银耳多糖经Sevage试剂重复操作8次后的紫外扫描图谱见图1,在260nm和280nm处无明显吸收,表明纯化得到的银耳多糖中已基本除去蛋白类杂质。然后经80%乙醇析出沉淀,真空冷冻干燥得银耳多糖,提取率为9.1%。2.2sevage试剂纯化的银耳多糖的制备硫酸苯酚法测定银耳多糖含量的标准曲线见图2,回归方程为y=1.3821x+0.0168,R2=0.9965,在葡萄糖浓度0.08~0.2mg/mL范围内线性关系良好,测得经Sevage试剂纯化的银耳多糖含量为80.03%。2.3y.0.4.4.3氯化乙酰胆碱标准品乙酰基浓度与其吸光度标准曲线见图3,回归方程为y=0.0118x+0.0036,R2=0.9991。在测定范围内线性关系良好,根据回归方程计算得乙酰化银耳多糖乙酰基浓度为11.75μg/mL,计算其取代度为0.214。3乙酰化银耳多糖结构解析及活性研究以水提醇沉法制备的银耳多糖经Sevage试剂处理8次得到较好的纯化效果,硫酸苯酚法测定其含量为80.03%,虽然该法对银耳多糖纯化效率较低但仍然是目前去除蛋白类杂质的常用方法,银耳多糖的提取率为9.1%。多糖在酸催化下进行酯化反应往往会伴随着多糖链的降解,为了抑制多糖链的降解过程可以选择在碱性条件下完成酯化反应;因此本文选择在氢氧化钠水溶液的均相体系中以乙酸酐为酰化试剂对银耳多糖进行乙酰化修饰,为了避免生成的酯在碱性条件下水解需要及时调整反应液的pH,在本实验条件下获得了低取代度的乙酰化银耳多糖(DS=0.214)。乙酰化多糖生物活性不仅受到乙酰基数量的影响,还与取代的位置相关,O-3位具有乙酰基时,多糖抗肿瘤活性最强;O-5位具有乙酰基时,抗肿瘤活性显著减弱;当O位全部乙酰化时,活性消失。因此对乙酰化银耳多糖进行结构解析以及相应的生物活性研究将成为我们后续研究的方向。精确移取氯化乙酰胆碱标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL,分别置于试管中,加水补足至1mL,加2mL新鲜配制的碱性羟胺溶液,摇匀,于室温中放置4min,加1mL4mol/L盐酸,使得pH=1.2±0.