负载洛拉曲克的壳聚糖纳米粒的制备及其体外抑瘤效应研究

负载洛拉曲克的壳聚糖纳米粒的制备及其体外抑瘤效应研究

盐酸罗拉西翁是本文根据胸漆反应中的三维结构设计和合成的特定添加剂。它干扰了dna合成，阻止了细胞分裂的形成，并发挥了肿瘤作用。Ⅱ期临床实验已证实其对头颈癌、结直肠癌及非小细胞肺癌等多种实体瘤有较好临床疗效。盐酸洛拉曲克具有高脂溶性、不发生多聚谷氨酸化的特点,所以易被动扩散进入细胞且不易产生耐药性,但因其在细胞内半衰期非常短,需持续静脉给药来维持其对癌细胞的毒性,结果引起正常组织的不良反应,包括皮疹、黏膜炎、中性粒细胞减少和血小板减少等,这种剂量限制性毒性影响其临床疗效发挥。为克服这些缺点,我们将洛拉曲克制备成壳聚糖纳米剂型,以期达到药物缓释、减少用药剂量及降低药物毒副反应的目的。壳聚糖(chitosan,CTS)是一种天然的高分子阳离子聚合物,由于其良好的生物可降解性、对生物黏膜较强的黏附性、无毒性及组织相容性,成为生物医用材料及基因、药物载体等领域的研究热点,尤其在药物缓释、靶向给药的应用中得到广泛关注。本实验以CTS为基质,通过离子交联法制备负载洛拉曲克的CTS纳米粒,初步探讨其对鼻咽癌细胞株的增殖抑制作用。1材料和方法1.1试剂:siga,mtt,性能好盐酸洛拉曲克(康辰医药发展有限公司)、CTS(平均相对分子质量2.0×105,脱乙酰度88%,Sigma公司)、多聚磷酸钠(TPP,上海国药集团)、四甲基偶氮唑盐(MTT,Sigma公司)、无水二甲亚砜(DMSO,广州威佳)、胰蛋白酶(Sigma公司)、新生牛血清(Gibco公司)、人鼻咽癌细胞(CNE-1,珠江医院中心实验室提供),其余试剂均为国产分析纯。1.2扫描电子显微镜79-1磁力加热搅拌器(中国江苏)、Uvikon923型紫外分光光度计(美国BioTek)、场发射扫描电子显微镜(JSM-6330F,日本电镜株式会社)、马尔文ZetasizerNanoZS90纳米粒度及Zet(英国马尔文公司)、低温冷冻干燥机(美国Labconco公司)、酶标仪(德国Leica)、水浴恒温振荡器(江苏亿通电子有限公司)。1.3方法1.3.1cts反应体系观察(chitosannanomicrosphere,CSNPs)的制备参考文献的方法略加改动,精密称取12mgCTS溶于1%的醋酸溶液,磁力搅拌至完全溶解,以1mol/L的NaOH调节pH至5.1,用0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤,溶液最终含CTS1.5mg/mL。称取适量TPP溶于双蒸水中,配成1mg/mLTPP溶液,依次用0.45μm和0.22μm滤膜过滤。取1.5mg/mLCTS溶液8mL,持续磁力搅拌作用下,将1mg/mLTPP溶液缓慢滴入CTS溶液中,观察反应体系外观。并取各反应体系溶液适量,马尔文ZetasizerNanoZS90纳米粒度仪测定平均粒径及粒径分布范围,剩余冷冻干燥,即得CSNPs。1.3.2tpp的搅拌取1.5mg/mLCTS溶液8mL,将2mg洛拉曲克溶于CTS溶液中,持续磁力搅拌作用下,缓慢将1mg/mLTPP溶液2mL滴入混合液中,继续磁力搅拌约1h。取溶液适量,马尔文ZetasizerNanoZS90纳米粒度仪测定平均粒径及粒径分布范围。余下悬液4℃10000r/min离心30min,弃上清,所得纳米粒冷冻干燥备用。1.3.3cspms的形态特征将干燥的载药纳米粒均匀散在样品平台上,用导电胶固定后喷金,电压加至5kV,扫描电镜观察其形态学特征及大小。1.3.4不同ph值对nltx-csnps载药率和包封率的影响采用紫外分光光度法测定载药纳米粒溶液中洛拉曲克的含量。检测波长298nm(洛拉曲克在298nm波长处有特征性吸收峰)。以空白纳米粒上清液溶解洛拉曲克,建立标准曲线,并计算线性回归方程。以1mol/LNaOH调整CTS溶液pH值,分别为4.1、4.6、5.1、5.4,制备NLTX-CSNPs,高速离心分离纳米粒,冷冻干燥备用。以同样pH值的CSNPs的上清液作为参照,紫外分光光度计检测上清液吸光度值,按下列公式计算NLTX-CSNPs的载药率(LC)及包封率(EE)。并考察不同pH值对载药率及包封率的影响。A:加入洛拉曲克的总量;B:上清液中游离的洛拉曲克的含量;C:所得纳米粒的质量。1.3.5载药纳米粒的累积释放率测定精密称取不同pH值的已知含量的载药纳米粒各4mg,混悬于4mL磷酸盐缓冲液(PBSpH7.4)中,置于透析袋中,悬浮于40mLPBS中,于37℃水浴中、50r/min磁力搅拌。分别于投药后0.25、0.5、1、1.25、1.5、2、3、4、5、6、7d取透析袋外PBS液4mL,同时补充同温度PBS4mL。紫外分光光度计测定不同时间点释放介质在298nm处吸光度值,按照下列公式计算载药纳米粒在各个时间点的累积释放率:ct:释放各时间点测得释放介质中的盐酸洛拉曲克的浓度(mg/mL);W:投入的载药纳米粒的总重量(mg);Vo:释放介质的总体积;V:每次取样的体积;X:纳米粒载药量(%)。1.3.6载药纳米粒与药物相互作用的筛选将对数期CNE-1鼻咽癌细胞用含10%新生牛血清的培养液配成单个细胞悬液,以每孔3×103个细胞(100μL)接种于96孔板,设置调零孔(不加细胞)、对照组(只加细胞及培养液),37℃5%CO2恒温孵箱中培养24h。将游离洛拉曲克、载药纳米粒、空白纳米粒溶解于RPMI-1640培养液中,并稀释成不同浓度(载药纳米粒的浓度以洛拉曲克浓度计算)。分别取不同药物浓度各20μL,加入已预培养24h的96孔板中,每组设4个复孔。加药后置于恒温孵箱中继续培养。分别于24、48、72h各取一96孔板,每孔加入5mg/mLMTT20μL,继续孵育4h,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,每孔加DMSO150μL,摇床震荡10min,使结晶物充分溶解,于酶标仪490nm波长处测定各孔吸光值(OD值),并按下述公式计算药物对细胞的增殖抑制率:细胞抑制率(%)=[1-(实验组OD值-调零孔OD值)]/(对照组OD值-调零孔OD值)×100%2结果2.1csnps的粒径通过激光粒度分析仪测定各反应体系的粒径可发现,随着滴加的TPP量的加大,粒子的平均粒径逐渐增加,当CTS/TPP质量比为6∶1时,CSNPs的平均粒径为200nm,多分散系数(PDI)为0.25(图1),NLTX-CSNPs的平均粒径为232nm,PDI为0.37(图2);5∶1时,CSNPs的平均粒径为356nm,PDI为0.29;4∶1时,CSNPs的平均粒径为480nm,PDI为0.406,纳米粒径出现双峰,6.5%左右的粒子粒径超过1110nm;3∶1时,混悬液中形成肉眼可见细颗粒沉淀。2.2cts纳米颗粒的形态特征2.3cts/tpp质量比对纳米粒载药率及包封率的影响洛拉曲克在0.0025~0.4mg/mL范围内与吸光度(A)呈良好的线性关系,标准曲线为y=-0.083+11.276x(R2=0.999)。本实验探讨了CTS与洛拉曲克的不同质量比对纳米粒的载药率及包封率的影响,同时探讨了CTS/TPP质量比为5∶1、CTS/NLTX质量比为6∶1时,不同pH值CTS溶液对纳米粒的载药率及包封率的影响。由表1可见,随着CTS/洛拉曲克的质量比的增大,包封率呈逐渐上升之势,而载药率逐渐下降。由表2可见,随着CTS溶液pH值的升高,纳米粒的载药率及包封率均呈上升趋势。2.4x-csnps体外释药部分由图4可见,4种不同pH值壳聚糖溶液(pH值为4.1、4.6、5.1、5.4)制备的NLTX-CSNPs体外释药曲线均可分为突释和缓释两部分。突释部分曲线陡直,药物释放迅速,1d内累计释药量分别达到54.14%、48.45%、39.67%、36.09%。缓释部分曲线平缓,7d内累计释药量达到92.70%、80.49%、63.67%、58.52%,表明载药纳米粒具有一定的缓释性能。2.5游离洛拉西翁、装载纳米颗粒和csi对1号肿瘤细胞株的克隆抑制作用见图5~7。3载药纳米粒的体外增殖抑制实验本实验利用CTS溶于醋酸溶液中其氨基基团发生质子化,带有大量正电荷,与TPP的阴离子发生分子间及分子内交联反应,即以离子交联法而制得纳米粒。本实验方法反应条件温和,不使用有机溶剂,并且可通过调整CTS与TPP的质量比从而调整纳米粒的粒径范围,满足生物医学应用要求。粒径分析结果显示随着CTS/TPP质量比的减小,纳米粒的粒径呈增大趋势,这可能由于TPP含量相对增多时,CTS的氨基基团被交联的较多,引起纳米粒径的增大。另外,本实验在制备纳米粒时,将药物以溶液状态加入CTS溶液中,纳米粒形成过程中可将药物包裹在纳米粒内或吸附在纳米粒表面,从而达到较高的包封率,且随着洛拉曲克药量的增多、CTS溶液pH值的增大,纳米粒的载药能力逐渐增强,而且可以实现持续缓慢释放性能。根据载药纳米粒的体外释药曲线,综合考虑载药纳米粒的粒径、粒径分布、载药率及包封率等各方面因素,CTS溶液pH为5.1、CTS/TPP质量比为6∶1、CTS洛拉曲克质量比6∶1时制备的载药纳米粒较为理想。体外增殖抑制实验显示载药纳米粒对人鼻咽癌细胞的增殖抑制作用呈时间、浓度依赖性。药物作用24h时,载药纳米粒各浓度组的抑制率均