转双价双b抗虫基因棉生育性状和产量性状上生物学特性的比较

转双价双b抗虫基因棉生育性状和产量性状上生物学特性的比较

0抗虫基因对水稻抗虫性能的影响托吡咯内毒素晶体蛋白基因（bt基因）。其在芽孢形成期可产生有杀虫活性的伴孢晶体——δ-内毒素,这种晶体毒素蛋白可毒杀多种鳞翅目、双翅目和鞘翅目等昆虫,是世界上应用最为广泛的生物杀虫剂。据统计已报道的Bt基因有60种以上。根据它们的杀虫范围和基因序列的同源性的不同,又可大致分为六大类:Cry1、Cry2、Cry3、Cry4、Cry5、Cryt。每一类中又包含不同的亚类,前5类称为晶体蛋白基因家族,第六类称为细胞外溶性晶体蛋白基因。1981年Shnepf和Whiteley等首次从苏云金芽孢杆菌中分离并克隆了Bt基因,美国孟山都公司将Bt基因经过启动子改造后转入棉花中,于1995年获得了2个转Bt基因抗虫棉NUCOTN33B和NUCOTN35B。1990年谢道昕等从苏云金芽孢杆菌亚种aizawai7-29和KurstakiHD-1中分离克隆了Bt基因,1992年谢道昕、郭三堆等对Bt基因进行了改造,并由中国农科院生物工程中心、中棉所等单位将改造了的Bt基因转入国产棉花品种中,于1994年成功获得了第一批国产单价抗虫棉。由于美国孟山都公司转Bt基因抗虫棉——33B、35B和中国第一批转Bt基因抗虫棉都是单价的转Bt基因抗虫棉,经棉田多年种植实践表明,这种单价Bt基因抗虫棉仅抗棉铃虫、红铃虫等少量鳞翅目害虫,对鳞翅目中其他害虫——斜纹夜蛾、甜菜夜蛾基本无抗虫性,更不抗鳞翅目以外的棉花害虫,如棉盲蝽、棉蚜、棉蓟马、棉叶螨、烟粉虱等。为了提高转基因抗虫棉的抗性,中国农科院棉花研究所等国内棉花育种单位近几年又推出了双价转Bt和豇豆胰蛋白酶抑制抗虫基因(Cry1Ac+CPTI)棉、双价双Bt抗虫基因(Cry1Ac+Cry2Ab)棉。转双价双Bt抗虫基因(Cry1Ac+Cry2Ab)棉MON15985已于2002—2009年先后在美国、南非、印度、澳大利亚、布基纳法索、哥斯达黎加、巴西、等国家商业化种植,目前研究大多集中在Cry1Ac抗性棉铃虫对Cry2Ab的交互抗性方面,其中罗术东、Luo、Mahon、高玉林等认为棉铃虫对Cry1Ac基因和Cry2Ab基因之间不存在交叉抗性,推断这2个基因在棉铃虫中肠上皮细胞膜上的结合位点不同,提出培育转双价双Bt基因(Cry1Ac+Cry2Ab)抗虫棉有利于延缓棉铃虫对Cry1Ac的抗性;Bruce等的试验结果表明,这2个基因对红铃虫存在非对称交叉抗性,在进行抗性管理中纳入对这种交互抗性潜在风险的考虑可以帮助研究者保持这种金字塔式的Bt作物的有效性。同时Stewart等认为,低温胁迫对Cry1Ac和Cry2Ab基因表达量的影响可以忽略不计,保证其在低温胁迫下有效表达。中国在这方面的研究相对落后,目前仍无商品化生产的转双价双Bt抗虫基因(Cry1Ac+Cry2Ab)棉花品种。中国在转基因抗虫棉环境安全评价技术上仅在2007年公布了一项技术标准,即农业部953号公告-12-2007。这项环境安全评价检测技术标准仅适用于单价转Bt基因抗虫棉。对于双价转基因抗虫棉国内暂缺环境安全评价技术标准,国家农业部从“十一五”开始设立双价转基因抗虫棉环境安全评价技术研究项目。本研究就是为转双价双Bt抗虫基因(Cry1Ac+Cry2Ab)棉环境安全评价技术的建立提供依据而进行的,以(Cry1Ac+Cry2Ab)棉和非转基因棉为研究材料,对二者生物学特性上的差异进行研究。1材料和方法1.1试验材料转双价双Bt基因抗虫棉花材料,由中国农科院棉花研究所提供;未转过基因的常规棉花——‘赣棉11号’(对照),为江西省棉花研究所品种。1.2方法1.2.1试验设施1.2.2苗繁殖1.2.3抗虫棉环境安全评价结果的测定发芽势=(发芽4天内正常苗数/供试种子数)×100%发芽率=(发芽12天正常苗数/供试种子数)×100%1.2.4调查转入基因后棉花原本的生育性状和生物学特性都会发生改变,所以必须对棉花的生育性状、产量性状等有关生物学特性进行全面的调查记载,为转双价双Bt基因抗虫棉环境安全评价技术的创建提供充足的依据。调查记录项目内容具体见表1。2结果与分析2.1抗虫基因棉生育期生长速度转双价双Bt抗虫基因棉与对照相比,从播种到吐絮整个生育期比对照短2天。这种稍快的生育期生长速度,转双价双Bt抗虫基因棉于二叶一心期开始快于对照1天,一直维持到现蕾期,之后从开花期开始,转双价双Bt抗虫基因棉生育期生长速度快于对照2天,一直维持到吐絮期。由于转双价双Bt基因抗虫棉全生育期生长速度仅比对照快2天,即与对照全生育期长短差距不大,所以转双价双Bt抗虫基因棉与对照相比在棉花生育期上无显著差异(表2)。表明转双价双Bt抗虫基因棉各生育期生长速度和全生育期长短与对照基本相当。2.2抗虫育种棉花的双价转移率不同于对照棉花2.2.1高个子2.2.2花蕾和脱落率2.2.3转双价双bt抗虫基因棉对第一果枝节位的影响从表6中可知,转双价双Bt抗虫基因棉第一果枝高度24.6cm,比对照高出3.0cm,差异显著,说明转双价双Bt抗虫基因棉与对照比,对第一果枝高度提升差异显著;转双价双Bt抗虫基因棉第一果枝节位7.6节,比对照低0.4节,差异不显著,说明转双价双Bt抗虫基因棉与对照比,对第一果枝节位影响不显著;转双价双Bt抗虫基因棉果枝节距12.9cm,比对照高出0.2cm,差异不显著,说明转双价双Bt抗虫基因棉与对照比,在果枝节距上差异不显著。从表7中可知,转双价双Bt抗虫基因棉果枝角度65.5°,低于对照0.1°,差异不显著,说明转双价双Bt抗虫基因棉与对照比,在果枝角度上无差异;转双价双Bt抗虫基因棉总果节数103.2个,比对照高出10.2个,差异显著,说明转双价双Bt抗虫基因棉与对照比,总果节数增加差异显著;转双价双Bt抗虫基因棉主茎节距4.9cm,比对照高出0.5cm,差异显著,说明转双价双Bt抗虫基因棉与对照比,主茎节距拉长差异显著。2.2.4伊兰士2.2.5霜前籽棉和温度对棉产量的影响从表9中的数据可以看出,转双价双Bt抗虫基因棉与对照比,籽棉和皮棉产量提高具有极显著的优化差异。但是,对霜前籽棉和皮棉产量减少变差差异也极显著。即转双价双Bt抗虫基因棉由于有极显著的增产效益,在推广种植可行性上价值极大,但是由于其霜前花产量极显著的比对照低,相对纤维品质和种子质量会明显降低,这样对纺织用棉和种子推广效益降低影响显著,在推广种植可行性目标上价值会打折扣。2.2.6产量性状变差由此看出,转双价双Bt抗虫基因棉因为与对照比单铃重、单铃籽棉重、单铃皮棉重下降,籽指升高,这些产量性状变差在测验上达极显著水平,使之在推广种植可行性目标价值上失分。2.2.7纤维质量分析2.2.8启动测试2.2.9影响根系3主要生物学特性此项研究通过田间试验证实,转双价双Bt抗虫基因棉与非转基因常规棉之间,在部分生物学特性上存在显著与极显著差异:(1)在5%水平上有显著差异的生物学特性,在5个生育性状(单株成铃数、第一果枝高度、总果节数、主茎节距、叶色)和2个纤维性状(纤维整齐度指数、马克隆值)上表现,与对照相比均为“+”显著差异。(2)在1%水平上有极显著差异的生物学特性集中在生殖性状(单铃壳重、单铃籽棉重、单铃皮棉重、籽指、发芽率)和产量性状(籽棉产量、皮棉产量、霜前籽棉产量、霜前皮棉产量)上。生殖性状中,单铃壳重、单铃籽棉重、单铃皮棉重3项生物学特性与对照相比表现为“-”极显著差异,籽指和发芽率2项为“+”极显著差异;产量性状中,籽棉产量、皮棉产量2项生物学特性与对照相比表现为“+”极显著差异,霜前籽棉产量和霜前皮棉产量两项与对照相比表现为“-”极显著差异。(3)从总体上看,由于转双价双Bt抗虫基因棉与非转基因常规棉相比在单株成铃数量、叶色加深、籽棉产量、皮棉产量、发芽率上具有显著或极显著的生物学特性优势,提高了推广种植可行性目标价值,利于棉农接受。但是霜前籽棉产量和霜前皮棉产量与非转基因常规棉相比,在生物学特性上表现为极显著弱势,纤维品质相对较差,降低了纺织上的价值。综上所述,总体评价:转双价双Bt抗虫基因棉与非转基因常规棉相比,在推广种植可行性目标上的价值性为一般。4发展转化棉生物学特性(1)本研究再次证实,不同的外缘基因转入棉花后,其生物学特性与非转基因常规棉比较,在不同的生物学特性上表现差异:如转双价抗病基因(Chi+Glu)转入棉花后与非转基因常规棉比较,对棉株高增长、第一果枝节位前移、发芽势,在5%水平上差异显著,对第一果枝高度在1%水平上差异极显著;而转双价双Bt抗虫基因(Cry1Ac+Cry2Ab)转入棉花后,其生物学特性与非转基因常规棉比较,在单株成铃数、第一果枝高度、总果节数、纤维整齐度指数、马克隆值这些生物学特性5%水平上差异显著,在单铃壳重、单铃籽棉重、单铃皮棉重、籽指、主茎节距1%水平上差异极显著。可见,这对评价不同转基因棉推广种植可行性、杂草化潜力和创建各自环境安全检测评价技术标准的应用依据是不完全一样的。所以,对于新的转基因棉必须用当地主推的非转基因常规棉为对照,设立田间试验,进行二者生物学特性上的差异检测,之后才有依据作出评价和创建该转基因棉独自的环境安全检测和评价技术标准。(2)根据作者多年对棉花各品种的种植观察,发现棉花各品种之间叶色表现在绿色程度上有差异,大体上可分为:墨绿、绿、浅绿、黄绿、红绿5种。所以将此5种绿色作为调查划分叶色差异的等级。由于无受体棉为对照,所以在本研究中转双价双Bt抗虫基因棉叶的绿色表现比非转基因常规棉深一个等级,这属于品种差别还是转入双价双Bt抗虫基因后所起的作用有待探讨。一般叶绿色加深,表明叶片中叶绿素含量多,光合作用力强,制造有机物质多,产量相对会得到提高,反之产量相对较低。外缘基因转入棉花后,对其生物学特性的表现只有经过全面的观察比较后,才能确定有哪些生物学特性与非转基因常规棉有显著或极显著差异。(3)棉花的根属直根系,即有明显的主根,主根上长有须根。自转基因抗虫棉推广种植后,作者发现这类品种与非转基因常规棉相比,不耐旱耐渍,易倒伏。然后拔根调查对比,发现转基因抗虫棉大都主根会明显分化成多条须根状主根、较短,有的抗虫棉品种甚至根变异到无主根,仅围绕主茎长须根,长出的须根呈八字状伸展,根较短,一般在10cm左右。由于转基因抗虫棉各品种根有不同程度的变异而分化、变短,根仅在土中10~15cm深,所以会表现出转基因抗虫棉对肥水条件更敏感,稍旱稍渍就会出现红叶茎枯病早衰症状,也是风雨后易倒伏的原因。所以在本研究中,作者在方法中自定了根的变异度,在棉花生物学特性上对根的变异度和长度进行调查,观察转双价双Bt抗虫基因棉与非转基因常规棉相比,二者棉根在生物学特性上有无差异,从而可为转双价双Bt抗虫基因棉种植上的农艺性定位寻找根据。外缘基因转入棉花后会引起根的变异,这已经在许多转Bt抗虫基因棉上有表现。但在国内已发表的有关文章上对此均无观察评价描述,而根的变异对转基因棉高产栽培技术影响很大,这关系到该品种推广种植可行性价值。因此,笔者在对转抗病基因棉生存竞争能力研究上,对根的变异度(包括长度)进行了界定观察和描述,以便今后为各种转基因棉在生物学特性上的研究向同行提供探索启示。(4)非转基因常规棉品种之间一些生物学特性是有差异的,如各品种之间产量高低、衣分率大小等。由于客观存在的原因。本项目研究主持单位中国农业科学院棉花研究提供不了相应的受体棉品种作对照,所以本研究缺乏双价双Bt抗虫基因(Cry1Ac+Cry2Ab)转入棉花后对棉花一系列生物学特性影响与受体棉产生生物学特性差异的标准值幅度并定位。这方面以后可以在(Cry1Ac+Cry2Ab)转入其他受体棉品种时用试验弥补。由于各转基因棉必须进行推广种植可行性价值和杂草化潜力评价,用当地大面积推广种植的非转基因常规棉作比较,对评价目标具有主导意义。试验地设在江西省棉花研究所内,试验地面积17.5m×10.5m,转双价双Bt基因抗虫棉材料为试验品种,未转基因棉花——‘赣棉11号’为对照品种,试验品种和对照品种各设4个重复,随机排列,每个重复小区面积17.5m×1.2m。每小区单行植棉50株,株距0.35m,常规耕作管理。转双价双Bt基因抗虫棉和对照的种子均经硫酸脱绒后种衣剂包衣,2011年4月15日营养钵播种后按22.5kg/hm2量撒施3%克百威颗粒剂防虫,籽土喷70%敌克松500倍稀释液对土壤进行消毒,苗床双膜覆盖,待子叶平展齐苗后撤去地膜,4月30日棉苗二叶一心期用卡那霉素4000mg/L稀释液喷施剔除转双价双Bt基因抗虫棉中杂株。5月11日移栽。按GB/T3543.4—1995进行。2011年11月22日至12月5日用试验地中当年收获棉种进行发芽测试。由表3可知,现蕾期(6月15日)转双价双Bt抗虫基因棉株高28.3cm,比对照高出4.2cm,与对照比差异极显著;花铃期(7月15日)转双价双Bt抗虫基因棉株高64cm,比对照高出3.3cm,与对照比差异不显著;盛铃期(8月15日)转双价双Bt抗虫基因棉株高117.3cm,比对照高出3.9cm,与对照比差异不显著;吐絮期(9月15日)转双价双Bt抗虫基因棉117.9cm,比对照高出4.7cm,与对照比差异不显著。结果表明转双价双Bt抗虫基因棉与对照比,对棉花现蕾期之前株高增长有极显著的差异,对现蕾期至吐絮期的株高增长有不显著的差异。从表4中可以看出,7月15日花铃期之前,转双价双Bt基因抗虫棉与对照之间单株蕾和铃数量测验无显著差异,到8月15日盛铃期,转双价双Bt基因抗虫棉现蕾数虽然与对照比测验上无显著差异,但是单株成铃数25.73个,低于对照4.45个,差异极显著;到9月15日吐絮期调查,转双价双Bt基因抗虫棉单株成铃数52.35个,反而高于对照12.5个,差异显著(表4)。8月15日调查脱落率,转双价双Bt基因抗虫棉与对照之间无显著差异。由此说明,转双价双Bt抗虫基因棉与对照比,单株现蕾无显著差异,但在8月15日盛铃期之前的单株成铃速度变缓差异极显著,之后直至9月15日吐絮期转双价双Bt基因抗虫棉与对照比,前者生长表现单株成铃超速增长量显著。转双价双Bt抗虫基因棉与对照比单株成铃脱落无差异。由表5可知,转双价双Bt抗虫基因棉与对照比果枝层数无差异。转双价双Bt抗虫基因棉与对照比棉花叶色加深有明显差异(表8)。2011年11月底,对试验地各小区进行收花产量实收秤测,结果:转双价双Bt抗虫基因棉籽棉产量3410.7kg/hm2,比对照高出268.05kg/hm2,差异极显著;皮棉产量1439.25kg/hm2,比对照高出118.35kg/hm2,差异极显著;霜前籽棉产量2603.4kg/hm2,低于对照220.95kg/hm2,差异极显著;霜前皮棉产量1098.6kg/hm2,低于对照88.5kg/hm2,差异极显著(表9)。由表10可知,转双价双Bt抗虫基因棉平均单铃重6.21g,低于对照0.54g,差异极显著,说明转双价双Bt抗虫基因棉与对照比,单铃重量下降差异极显著;转双价双Bt抗虫基因棉平均单铃壳重1.40g,低于对照0.10g,差异不显著,说明转双价双Bt抗虫基因棉与对照比,单铃壳重下降无显著差异;转双价双Bt抗虫基因棉平均单铃籽棉重4.81g,低于对照0.44g,差异极显著,说明转双价双Bt抗虫基因棉与对照比,单铃籽棉重量下降差异极显著;转双价双Bt抗虫基因棉平均单铃皮棉重2.03g,低于对照0.18g,差异极显著,说明转双价双Bt抗虫基因棉与对照比,单铃皮棉减少差异极显著;转双价双Bt抗虫基因棉小样衣分率42.20%,高于对照0.17g,差异不显著,说明转双价双Bt抗虫基因棉与对照比,小样衣分率增加差异不显著;转双价双Bt抗虫基因棉籽指10.73g,高于对照1.65g,差异极显著,说明转双价双Bt抗虫基因棉与对照比,籽指升高差异极显著;转双价双Bt抗虫基因棉衣指6.80g,低于对照0